Luận án phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm và tổng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ XÃ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ TỔNG HỢP IAA ĐỂ CANH TÁC RAU Ở SÓC TRĂNG LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINH CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH 62420201 NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ XÃ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ TỔNG HỢP IAA ĐỂ CANH TÁC RAU Ở SÓC TRĂNG LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINH CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH 62420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN PGS. NGUYỄN KHỞI NGHĨA TS. PHẠM NGỌC TÚ NĂM 2021 PHẦN KÝ DUYỆT Cần Thơ, ngày tháng năm 2021 NGƢỜI HƢỚNG DẪN CHÍNH NGHIÊN CỨU SINH PGS. NGUYỄN KHỞI NGHĨA LÊ THỊ XÃ LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận án tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của nhiều cá nhân và tập thể.

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến tập thể và những cá nhân có tên dưới đây đã góp sức để giúp đỡ tôi hoàn thành các nghiên cứu trong luận án này. Đầu tiên và quan trọng nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới gia đình và những người thân yêu vì sự đồng hành, chia sẻ, nhẫn nại, tình yêu và cả sự hỗ trợ về tinh thần, tài chính trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu của tôi trong bốn năm qua. Xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến hai cán bộ hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Khởi Nghĩa-Phó trưởng bộ môn Khoa học Đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ và TS. Phạm Ngọc Tú-Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu long.

Đặc biệt là PGS. Nguyễn Khởi Nghĩa- người Thầy đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu, hỗ trợ phương tiện nghiên cứu, đồng thời truyền đạt kinh nghiệm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án cũng như quá trình viết báo khoa học. Xin gửi lời cảm ơn đến các em Nguyễn Thị Kiều Oanh, Ngô Thị Phương Thảo, Đỗ Thành Luân, Đặng Thị Yến Nhung, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Hoàng Kim Nương là cán bộ nghiên cứu thuộc phòng thí nghiệm Vi sinh vật Đất, bộ môn Khoa học đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ cùng các em sinh viên ngành Khoa học Đất khoá 41 thuộc bộ môn Khoa học Đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ gồm Giang Yến Anh, Thị Hạnh Nguyên, Nguyễn Thị Thuý Cầm và em học viên cao học Quách Thị Trúc Ly ngành Sinh thái học khoá 24 thuộc bộ môn Sinh học, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ tôi thực hiện các thí nghiệm trong nghiên cứu này. Xin cảm ơn các em Nguyễn Thị Kiều Anh nghiên cứu viên phòng thí nghiệm vi sinh vật đất, bộ môn Khoa học đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ, em Trần Hoàng Ty học viên cao học lớp Sinh thái học khoá 25 thuộc bộ môn Sinh học, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ, em Lâm Thanh Tâm sinh viên ngành khoa học đất khoá 41 bộ môn Khoa học đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ, cùng các em sinh viên lớp Bảo vệ Thực vật khoá 43 thuộc bộ môn Bảo vệ thực vật, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ đã hỗ trợ tôi trong các thí nghiệm nhà lưới và ngoài đồng.

Xin cảm ơn các anh chị em nghiên cứu sinh khoá 2016-2020 thuộc viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt là em nghiên cứu sinh Trần Võ Hải Đường đã động viên, chia sẻ kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành quyển luận án nghiên cứu sinh cũng như các loại hồ sơ trong suốt quá trình học tập. Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, quý Thầy/Cô thuộc viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã trang bị cho tôi những kiến thức quý báu, động viên và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Xin cảm ơn tập thể cán bộ, giảng viên, nghiên cứu viên phòng thí nghiệm Vi sinh vật Đất và phòng thí nghiệm Hoá học Đất thuộc bộ môn Khoa học Đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ đã chia sẻ kinh nghiệm, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành các nghiên cứu trong luận án. Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo các Sở Giáo dục và Đào tạo, Sở Nội Vụ tỉnh Sóc Trăng và Uỷ ban Nhân dân tỉnh Sóc Trăng đã tạo điều kiện để tôi được học tập và nghiên cứu nâng cao trình độ.

Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Khoa Sau Đại học và Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học tập và nghiên cứu trong suốt năm năm qua dưới mái trường thân yêu này. Xin cảm ơn Ban giám hiệu, tập thể giảng viên và cán bộ trường Cao đẳng Sư phạm Sóc Trăng, trường Cao đẳng Cộng đồng Sóc Trăng đã động viên và tạo điều kiện cho tôi học tập, nghiên cứu trong thời gian qua. Xin trân trọng cảm ơn với tấm lòng thành kính nhất! LỜI BẢN QUYỀN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân nghiên cứu sinh dưới sự hướng dẫn của PGS. Nguyễn Khởi Nghĩa và TS.

Các số liệu trình bày trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu hay luận văn nào trước đây. Cán bộ hƣớng dẫn 1 Cán bộ hƣớng dẫn 2 Tác giả luận án PGS. Nguyễn Khởi Nghĩa TS. Phạm Ngọc Tú Lê Thị Xã TÓM LƢỢC Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm đánh giá hai chức năng cố định đạm và tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) của một số hệ vi sinh vật bản địa (indigenous microorganism-IMO) thu thập từ các hệ thống canh tác cây trồng khác nhau ở Sóc Trăng đồng thời phân lập, tuyển chọn những dòng vi khuẩn có 2 chức năng này trong các IMO có khả năng kích thích sinh trưởng, làm tăng năng suất rau muống và cải xanh trồng ở Sóc Trăng.

Môi trường Burks khuyết đạm đã được sử dụng để phân lập vi khuẩn cố định đạm và phương pháp so màu phản ứng với thuốc thử phenol nitroprusside và Salkowski lần lượt để xác định hàm lượng đạm và IAA trong môi trường lỏng ở bước sóng 636 nm và 530 nm. Khả năng kích thích hạt nảy mầm và kích sinh trưởng cây rau muống và cây cải xanh của các dòng vi khuẩn và IMO tuyển chọn được đánh giá ở các điều kiện phòng thí nghiệm, nhà lưới và ngoài đồng. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy các hệ IMO thu thập từ các hệ thống cây trồng khác nhau ở tỉnh Sóc Trăng có sự đa dạng vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn. Trong đó vi khuẩn là nhóm hiện diện với mật số cao và đa dạng hơn hai nhóm còn lại.

Ngoài ra, kết quả đã chỉ ra rằng không có sự hiện diện của nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột cho người như Salmonella, Shigella, E. coli và Coliform trong các hệ IMO thu thập. Đặc biệt, tất cả các hệ IMO khảo sát còn cho thấy chúng có chức năng tổng hợp IAA và cố định đạm vì có sự hiện diện của nhóm vi khuẩn mang gen nifH với mật số vi khuẩn cố định đạm dao động từ 106-108 cfu. Trong đó, Luận án đã phân lập được 44 dòng vi khuẩn có 2 chức năng cố định đạm, tổng hợp IAA và đã tuyển chọn được 10 dòng vi khuẩn tốt nhất chúng thuộc 5 chi: Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Paraburkholderia và Pseudomonas.

Kết quả đánh giá ở điều kiện phòng thí nghiệm cho thấy 5 hệ IMO tuyển chọn và 5 dòng vi khuẩn tuyển chọn gồm Paraburkholderia tropica TP-1.3, Paenibacillus cineris TP-1.4, Bacillus megaterium MQ-2.5, Klebsiella pneumoniae MT-16.5, và Bacillus megaterium OM-17.5, cho hiệu quả tương đương nhau trong kích thích gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt rau muống (14-15%) và hạt cải xanh (3-5%), cũng như làm tăng chiều cao thân, chiều dài rễ và sinh khối tươi cây rau. Kết quả thí nghiệm nhà lưới cho thấy dòng vi khuẩn tuyển chọn cho hiệu quả kích thích sinh trưởng tốt hơn các hệ IMO và trong đó 3 dòng vi khuẩn TP-1.5 giúp giảm 25% lượng phân đạm bón theo khuyến cáo nhưng vẫn cho năng suất cây rau tương đương với nghiệm thức bón 100% NPK khuyến cáo. Đặc biệt, ở điều kiện ngoài đồng ba dòng vi khuẩn tuyển chọn giúp tăng năng suất rau muống và cải xanh từ 10- 20% dù bón giảm 25% lượng đạm theo khuyến cáo, đồng thời còn giúp giảm lượng nitrate lưu tồn trong rau từ 40-60% so với nghiệm thức đối chứng. Tóm lại, có thể ứng dụng 3 dòng vi khuẩn TP-1.5 và hỗn hợp của chúng trong canh tác rau sạch và rau an toàn ở tỉnh Sóc Trăng.

Từ khoá: cải xanh, kích thích sinh trưởng cây trồng, rau muống, vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn tổng hợp IAA, vi sinh vật bản địa ABSTRACT The main objective of this study was to evaluate some of basic functions of several indigenous microorganism (IMOs) collected from different crop farming systems in Soc Trang as well as to isolate and select indigenous bacteria capable of fixing nitrogen and synthesizing IAA from these IMOs for plant growth promotion, yield enhancement of water spinach, mustard green in Soc Trang province. N-free Burk’s medium was used to isolate nitrogen-fixing bacteria. Nitrogen and IAA concentrations in liquid media were determined by phenol nitroprusside and Salkowski's reagent method at a wavelength of 636 and 530 nm with the help of spectrophotometer, respectively. The seed germination rate, growth and yield performance testes were carried out under laboratory, greenhouse and field conditions.

The results showed that all collected IMOs had a diversity of three main microbial groups including bacteria, fungi and actinomyces. In which, bacterial group was the most predominant one. Moreover, there was no presence of bacterial group causing human intestinal infections such as Salmonella, Shigella, E. coli and Coliform in all collected IMOs.

Besides, all IMOs revealed their good abilities in biological nitrogen fixation, IAA synthesis. Especially, all IMOs were found the sequence of nifH gene with the number of N-fixing bacteria varied 106-108 cfu. Therefore, a total of 44 bacterial strains capable of both fixing nitrogen and synthesizing IAA were isolated and identified the most 10 outstanding bacteria, they belonged to 5 different genera including Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Paraburkholderia, and Pseudomonas. The results of laboratory conditions test indicated that five selected IMO and the best 5 selected isolates included Paraburkholderia tropica TP-1.3, Paenibacillus cineris TP- 1.4, Bacillus megaterium MQ-2.5, Klebsiella pneumoniae MT-16.5 and Bacillus megaterium OM-17.5, equally effective in stimulating germination of water spinach seeds (14-15%) and mustard green seeds (3-5%), Besides, they also helped to increase stem height, root length and fresh biomass of water spinach and mustard green.

The pot experiment showed that isolated strains were more effective than IMOs in stimulating growth, in which 3 strains, TP-1.