Luận án nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP ĐẶNG MINH HIỀN NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TRONG CHẾ BIẾN BỘT PROTEIN THỦY PHÂN TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA SỬ DỤNG LÀM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÃ NGÀNH: 62.01 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME PROTEASE TRONG CHẾ BIẾN BỘT PROTEIN THỦY PHÂN TỪ PHỤ PHẨM CÁ TRA SỬ DỤNG LÀM MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT NGHIÊN CỨU SINH ĐẶNG MINH HIỀN MSNCS: P1114001 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS. NGUYỄN CÔNG HÀ 2021 Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Luận án nghiên cứu được hoàn thành tại bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ. Để hoàn thành được luận án này nhờ vào sự nỗ lực của chính tác giả và sự giúp đỡ vô cùng quý báo của giáo viên hướng dẫn, các thầy cô, Cơ quan công tác, Công ty Caseamex, Công ty CP thủy sản Đại Đại Thành, Công ty 404, gia đình và bạn bè. Tôi thật lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc đến: PGs.

Nguyễn Công Hà đã tận tình hướng dẫn, Trao đổi, động viên và giúp đỡ tôi vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này. Quý thầy, cô bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập. Các cán bộ phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm và phòng thí nghiệm Sinh học đất, bộ môn Khoa học đất đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn. Quý Công ty GEPIMEX 404, Công ty CP thủy sản Đại Đại Thành, Caseamex đã tạo điều kiện cho tôi có được nguyên liệu để làm thí nghiệm và hoàn thành luận văn.

Cám ơn tất cả bạn bè, anh chị em lớp cao học Công nghệ thực phẩm khóa 19, 20, 21, các em sinh viên đại học Công nghệ thực phẩm khóa 38, 39 đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Đặc biệt, cám ơn gia đình và quý thầy cô đã ủng hộ, động viên, khích lệ và cũng là điểm tựa vững chắc cho tôi trong suốt thời gian học tập. Xin chân thành cám ơn! Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2021 Nghiên cứu sinh Đặng Minh Hiền Ngành Công nghệ Thực phẩm i Khoa Nông Nghiệp Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Cá tra dầu (Pangasius hypophthalmus) được biết đến là một trong những mặt hàng xuất khẩu chủ lực của Việt Nam với phi lê là sản phẩm chính của ngành chế biến cá tra được ưa chuộng tại nhiều quốc gia trên thế giới. Một số nghiên cứu đã được tiến hành về quá trình thủy phân các sản phẩm phụ của cá bằng cách sử dụng enzyme; các nghiên cứu tập trung vào việc cải thiện mức độ thủy phân để cải thiện hoạt động chống oxy hóa của chúng; nghiên cứu quá trình thủy phân các sản phẩm phụ của cá tra bằng cách sử dụng nhiều protease và động học thủy phân.

Cho đến nay, chưa có thông tin nào về việc thủy phân thịt vây và máu cá tra bằng các enzym protease (bromelain, papain, neutrase) để ứng dụng nuôi cấy vi sinh vật. Ngoài ra, nghiên cứu này là nghiên cứu đầu tiên cho thấy động học thủy phân của các enzyme này trên hai cơ chất và xu hướng thay đổi của hàm lượng acid amin trong quá trình thủy phân protease liên quan đến sự phát triển của vi sinh vật. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật đã được thực hiện với ba nội dung bao gồm: (1) Nội dung 1: tách hàm lượng mỡ trong thịt dè cá, tiến hành thí nghiệm thủy phân trên phụ phẩm thịt dè cá bằng các enzyme bromelain, papain và neutrase, dung dịch thủy phân đem sấy phun thu sản phẩm bột protein thủy phân; (2) Nội dung 2: các thử nghiệm được thực hiện tương tự như nội dung 1 trên phụ phẩm máu cá tra; (3) Nội dung 3: tiến hành nuôi cấy vi sinh vật (vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm mốc Aspergillus oryzae) trên các môi trường là sản phẩm tối ưu của thử nghiệm thủy phân protein thịt dè cá và máu cá. Sau quá trình thực hiện, nghiên cứu đã ghi nhận các kết quả như sau: (1) Nội dung 1: kết quả cho thấy phụ phẩm thịt dè cá tra được tách béo bởi dung dịch NaHCO3 ở nồng độ 0,2%, có khả năng tách béo tốt nhất, hiệu suất thủy phân của các enzyme hiệu quả ở tỷ lệ khối lượng enzyme và cơ chất là 2,25 mg enzyme (mgE)/1,17 g protein (gPro) đối với enzyme bromelain, 1,5 mgE/1,17gPro đối với enzyme papain và 0,625 mgE/0,975 gPro đối với enzyme neutrase; bên cạnh đó, hiệu suất thủy phân tyrosin và đạm amin bằng enzyme bromelain ở thời điểm 240 phút tương ứng 65,25% và 71,02%, của enzyme papain là 57,74% và 67,22%, enzyme neutrase là 42,69% và 52,51%; hàm lượng acid amin tự do tăng theo thời gian thủy phân đồng thời bởi 3 enzyem, lượng acid amin tự do thủy phân bromelain > papain > neutrase.

(2) Nội dung 2: Đối với phụ phẩm máu cá tra được tách béo bởi dung dịch NaHCO3 ở nồng độ 0,2%, có khả năng tách béo tốt nhất; hiệu suất thủy phân của các enzyme hiệu quả ở tỷ lệ khối lượng enzyme và cơ chất là 2,1 mg enzyme (mgE)/0,69 g protein (gPro) đối với enzyme bromelain, 1,2 mgE/0,598 gPro đối với enzyme papain và 0,7 mgE/0,690 gPro đối với Ngành Công nghệ Thực phẩm ii Khoa Nông Nghiệp Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ enzyme neutrase; bên cạnh đó, hiệu suất thủy phân tyrosine và đạm amin bằng enzyme bromelain ở thời điểm 240 phút tương ứng 95,93% và 75,65%, của enzyme papain là 76,62% và 70,91%, enzyme neutrase là 59,17% và 63,65%. Hàm lượng acid amin tự do tăng theo thời gian thủy phân đồng thời bởi 3 enzyme, lượng acid amin tự do thủy phân bromelain > papain > neutrase. (3) Nội dung 3: Các sản phẩm thủy phân từ thịt dè và máu cá tra đã được sử dụng làm môi trường dinh dưỡng nuôi chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và nấm mốc Aspergillus oryzae cho thấy hiệu quả tốt hơn so với môi trường peptone thương mại thông qua đường cong tăng trưởng và khả năng sinh tổng hợp protease của các vi sinh vật này trên các môi trường thử nghiệm. Từ khóa: bromelain, papain, neutrase, phụ phẩm cá tra, thủy phân, dịch thủy phân protein.

Ngành Công nghệ Thực phẩm iii Khoa Nông Nghiệp Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ ABSTRACT Catfish (Pangasius hypophthalmus) is known as one of the mainly export products of Vietnam with fillets being the main product of pangasius processing, which is popular in many countries around the world. A few studies have been conducted on the enzymatic hydrolysis of fish by-products using enzyme; the studies were focusing on improving degree of hydrolysis in order to improve their antioxidant activity; study the hydrolysis of channel catfish by-products by using multiple proteases and hydrolysis kinetics. Until now, no information has been reported on hydrolysis of fin meat and blood of catfish by protease enzymes (bromelain, papain, neutrase) for application of cultural microorganism. In addition, this study is the first to show hydrolysis kinetics of enzymes on two substrates and the acid amin content pattern changes during protease hydrolysis connecting to develope of microorganism.

Therefore, the study on the application of protease enzyme in processing hydrolyzed protein powder from pangasius by-products used as microbial culture medium was carried out with three contents including: (1) Content 1: defatted in fish fin meat, hydrolysis experiment was proceeded on catfish by- products by enzymes bromelain, papain and neutrase, the hydrolysate was spray-dried to obtain hydrolyzed protein powder; (2) Content 2: the tests were performed similarly to content 1 on catfish blood by-product; (3) Content 3: Culturing microorganisms (Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae) on the media was the optimal product of the experiment of hydrolysis of protein fin meat and fish blood. After the conducted experiment, the research has recorded the following results: (1) Content 1: the results showed that pangasius belly by-products were defatted by NaHCO3 solution at a concentration of 0,2%, possibly fat separation the best; the hydrolysis efficiency of enzymes were effective at the enzyme mass to substrate ratio is 2,25 mg enzyme (mgE)/1.17 g protein (gPro) for bromelain enzyme, 1,5 mgE/1,17gPro for papain enzyme and 0,625 mgE/0,975 gPro for neutrase enzyme; besides, the hydrolysis efficiency of tyrosin and amino proteins by bromelain enzyme at 240 minutes to 65,25% and 71,02%, of papain enzyme to 57,74% and 67,22%, enzyme neutrase to 42,69% and 52,51%, corresponding; free amino acid content increases with hydrolysis time at all three enzyems, free amino acid hydrolyzed by bromelain>papain>neutrase. (2) Content 2: For pangasius blood by-product, which was defatted by NaHCO3 solution at a concentration of 0.2%, has the best ability to separated fat; the hydrolysis efficiency of enzymes reached optimation at the enzyme and substrate mass ratio to 2,1 mg enzyme Ngành Công nghệ Thực phẩm iv Khoa Nông Nghiệp Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ (mgE)/0,69 g protein (gPro) of bromelain enzyme, 1,2 mgE/0,598 gPro of papain enzyme and 0,7 mgE/0,690 gPro of neutrase enzyme; beside that, the hydrolysis efficiency of tyrosin and amino proteins by bromelain enzyme at 240 minutes, respective to 95,93% and 75,65%, the papain enzyme to 76,62% and 70,91%, the enzyme neutrase to 59,17% and 63,65%. The content of free amino acids increases with the hydrolysis time simultaneously by 3 enzymes, the amount of free amino acids hydrolyzed by bromelain> papain> neutrase.

(3) Content 3: Hydrolyzed products from pangasius belly and pangasius blood were used as a nutrient medium for strains of Bacillus subtilis and Aspergillus oryzae, which showed better efficiency than comercial peptone through growth and protease biosynthesis of these microorganisms on test media. Keywords: bromelain, papain, neutrase, catfish by-product, hydrolyzate, Bacillus subtilis, Aspergillus oryzae Ngành Công nghệ Thực phẩm v Khoa Nông Nghiệp Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CAM ĐOAN Luận án “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease trong chế biến bột protein thủy phân từ phụ phẩm cá tra sử dụng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật” được tác giả thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Nguyễn Công Hà, khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ. Tôi xin cam kết các kết quả, số liệu luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ công trình nào khác.

Ngành Công nghệ Thực phẩm vi Khoa Nông Nghiệp Luận án tốt nghiệp tiến sĩ Khóa 14 – Đợt 1 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN. iv DANH SÁCH BẢNG. xii DANH SÁCH HÌNH. xiii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .