Luận án nghiên cứu đặc điểm cấu trúc một số gen thuộc hệ miễn dịch tôm sú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN HOÀNG THỊ THU YẾN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC MỘT SỐ GEN THUỘC HỆ MIỄN DỊCH TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 70 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PHẠM ANH TUẤN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS. Nông Văn Hải và TS. Phạm Anh Tuấn đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và hết lòng giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu này.

Tôi xin cảm ơn các cấp Lãnh đạo Đại học Thái Nguyên, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, Khoa Sinh - KTNN và Khoa Sau đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Phòng trọng điểm Công nghệ gen, tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng ADN ứng dụng thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đặc biệt là TS. Kim Thị Phƣơng Oanh đã tạo điều kiện về vật chất, phương tiện và giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn các cấp Lãnh đạo Trường Đại học khoa học, Khoa Khoa học Sự sống, Phòng ĐT - KH và QHQT đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài luận án.

Tôi xin cảm ơn tập thể nghiên cứu thực hiện đề tài cấp nhà nước: “Nghiên cứu giải trình tự một phần bộ gen và xây dựng cơ sở dữ liệu genome tôm sú (P. monodon)” thuộc Chương trình Công nghệ sinh học thủy sản 2008-2010, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã tạo điều kiện về kinh phí để tôi thực hiện luận án. Tôi cũng xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, các bạn đồng nghiệp, những người luôn động viên, khuyến khích và giúp đỡ về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành công việc nghiên cứu của mình. Thái Nguyên, tháng 8 năm 2012 Tác giả luận án Hoàng Thị Thu Yến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan tấ t cả các kết quả nghiên cứ u trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Nế u sai tôi xin chị u trá ch nhiệm hoàn toàn. Thái Nguyên, tháng 8 năm 2012 Tác giả luận án Hoàng Thị Thu Yến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.i LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT.vi DANH MỤC CÁC BẢNG.viii DANH MỤC CÁC HÌNH.ix MỞ ĐẦU.

Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.3 Tôm sú và các bệnh thường gặp ở tôm sú.3 Giới thiệu về tôm sú.3 Tình hình nuôi và dị ch bệ nh tôm sú ở Việ t Nam.5 Các bệnh thường gặp ở tôm sú. 7 Phương phá p phòng và trị bệnh ở tôm sú.12 Hệ miễn dịch tôm sú.14 Đáp ứng miễn dịch tế bào.

15 Đáp ứng miễn dịch dịch thể. 21 Nghiên cứ u gen và tiề m năng ứ ng dụ ng trong phò ng trị bệ nh cho tôm s.23 Tình hình nghiên cứu genome tôm sú trên thế giới.23 Nghiên cứu gen liên quan đế n khả năng miễ n dị ch ở tôm sú.24 Tiề m năng ứng dụ ng củ a gen liên quan đế n miễ n dị ch trong phò ng trị bệnh ở tôm sú. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP. 32 Thu thập mẫu.32 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn iv Hóa chất 32 Thiết bị 34 Các vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu.34 Phương pháp nghiên cứu.

35 Tách chiết RNA tổng số.36 Tinh sạch mRNA.37 Tổng hợp cDNA. 38 Thiết kế mồi phân lập một số gen (cDNA) lựa chọn.41 Khuếch đại gen bằng phản ứng PCR.48 Tinh sạch sản phẩm PCR. 49 Tạo dòng phân tử sản phẩm PCR.49 Xác định trình tự gen (cDNA).50 Biểu hiện gen ALFPm3.50 Phân tích dữ liệu trình tự và xử lý số liệu.55 Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.56 Gen Rab7 - protein liên quan đế n cơ chế xâm nhiễ m củ a virus.56 Tạo dòng gen Rab7 từ mẫu tôm sú Việt Nam.56 Xác định và phân tích trình tự gen Rab7.58 Gen syntenin - protein liên quan đến con đườ ng dẫ n truyề n tí n hiệ u.61 Phân lậ p đoạn 5‟-syntenin từ mẫu tôm sú Việt Nam.62 Tạo dòng gen syntenin hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam.64 Xác định và phân tích trình tự gen syntenin.65 Gen hemocyanin - protein có hoạt tính phenoloxidase.68 Phân lập đoạn 5‟-hemocyanin từ mẫu tôm sú Việt Nam.69 Tạo dòng gen hemocyanin hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam.72 Phân tích trình tự gen hemoccyanin.74 Gen Ran - protein điề u khiể n thự c bà o.

76 Tạo dòng một phần đoạn gen Ran từ mẫu tôm sú Việt Nam.77 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn v Phân lập đoạn gen 3‟ và 5‟-Ran.78 Tạo dòng gen Ran hoàn chỉnh từ mẫu tôm sú Việt Nam.82 Xác định và phân tích trình tự gen Ran.83 Gen caspase - protein tham gia và o cơ chế apoptosis.84 Tạo dòng gen caspase từ mẫu tôm sú Việt Nam.85 Xác định và phân tích trình tự gen caspase.86 Hệ thống cácgen mã hóa protein khá ng khuẩ n, kháng nấm và kháng virus.90 Gen mã hóa protein khá ng virus PmAV.90 Gen mã hóa peptide khá ng khuẩ n t ương tự crustin (crustin - like antimicrobial peptide).94 Gen mã hóa yếu tố kháng khuẩn (ALF - antiliposaccharide factor).99 Biể u hiệ n yế u tố khá ng khuẩ n tái tổ hợp (rALFPm3).105 Tạo cấu trúc vector biểu hiện gen.105 Xác định cấu trúc gen ALFPm3 được chuyển vào genome nấm men.108 Xác định đoạn peptide ALFPm3 được biểu hiện.109 Phân tích hoạt tính của rALFPm3. 111 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.114 CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.115 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh 5‟UTR Vùng 5‟ không dịch mã 5‟ Untranslated region 3‟UTR Vùng 3‟ không dịch mã 3‟ Untranslated region AAP Mồi neo Abridged anchor primer AFLP Đa hình chiều dài DNA được Amplified fragment length khuếch đại polymorphism ALF Yếu tố kháng khuẩn Anti-lipopolisaccharide factor ALFPm ALF dạng 1 ở tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus monodon isorform 1 ALFPm3 ALF dạng 3 ở tôm sú Anti-lipopolisaccharide factor Penaeus monodon isorform 3 AMP Peptide kháng khuẩn Antimicrobial peptide apoptosis Tế bào chết theo chương trình Programmed cell death bp Cặp base Base pair B.megaterium Bacillus megaterium Bacillus megaterium cDNA DNA bổ sung Complement DNA DP Mồi suy diễn Degenerate primer DNA Axit deoxyribonucelic Deoxyribonucleic acid dNTPs Hỗn hợp các nucleotide (dATP, Deoxyribonucleoside triphosphate dCTP, dGTP, dTTP) ddNTPs Hỗn hợp các deoxynicleotide Dideoxyribonucleoside triphosphate (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) dsRNA RNA sợi kép Double stranded RNA DEPC Chất khử Rnase Diethyl pyrocarbonate E. aerogenes Vi khuẩn Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes E. coli Vi khuẩn Escherichia coli Escherichia coli EDTA Axit ethylenediaminetetraacetic Ethylenediaminetetraacetic acid EST Đoạn trình tự gen biểu hiện Expressed sequence tag GSP Mồi đặc hiệu gen Gene specific primer Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn vii kb Kb Kilo base LB Môi trường LB Luria Bertani mtDNA DNA ty thể Mitochondrial DNA mRNA RNA thông tin Messenger RNA OD Mật độ quang Optical density ORF Khung đọc mở Open reading frame PCR Phản ứng chuỗi polymerase Polymerase chain reaction PmAV Gen khá ng virus ở tôm sú Penaeus monodon antivrus PmRab7 Rab7 ở tôm sú Penaeus monodon Rab7 P.

pastoris Nấm men Pichia pastoris Pichia pastoris 3‟RACE Khuếch đại nhanh đầu 3‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 3' ends 5‟RACE Khuếch đại nhanh đầu 5‟ cDNA Rapid amplification of cDNA 5' ends rALFPm3 ALF tái tổ hợp ở tôm sú dạng 3 từ Recombinant anti-lipopolisaccharide tôm sú factor Penaeus monodon 3 RNA Axit ribonucleic Ribonucleic acid RNAi RNA can thiệp RNA interference RNase Enzyme phân hủy RNA Ribonuclease RT Enzyme phiên mã ngược Reverse transcriptase RT-PCR PCR bằng enzyme phiên mã ngược Reverse transcriptase-PCR siRNA RNA can thiệp nhỏ Small interfering RNA SNP Đa hình các nucleotide đơn Single-nucleotide polymorphism SSC Dung dị ch Natri citrate Solution sodium citrate TSV Virus gây hội chứng taura Taura syndrome virus UAP Mồi khuếch đại chung Universal amplication primer UPM Hỗn hợp mồi chung Universal primer mix v/p vòng/phút rotor/minute WSSV Virus gây bệnh đốm trắng White spot syndrome virus YHV Virus gây bệnh đầu vàng Yellow head virus YP Môi trường YP Yeast peptone YPD Môi trường YPD Yeast peptone dextrose Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Thố ng kê cá c gen liên quan đế n hệ miễ n dị ch ở tôm. Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu. Trình tự các mồi sử dụng trong nghiên cứu.47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.

Hình ảnh tôm sú. Tôm sú nhiễm WSSV. Tôm sú nhiễm YHV. Tế bào má u tôm sú.

Hệ thống hoạt hóa proPO và tổng hợp melanin. Cơ chế đông máu ở tôm. Sơ đồ phân lập gen. Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết trình tự.

Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết một phần trình tự đầu 3‟ (Invitrogen). Sơ đồ thiết kế mồi từ gen đã biết một phần trình tự đầu 3‟ (Clontech). Sơ đồ thiết kế mồi khi biết một phần trình tự đầu 5‟ của gen. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen syntenin.

Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen hemocyanin. Sơ đồ thiết kế mồi phân lập gen Ran. Sơ đồ thiết kế mồi để phân lập gen hoàn toàn mới ở tôm sú. Sơ đồ thiết mồi khuếch đại đoạn gen mã hóa peptide ALFPm3 trưởng thành.

Sơ đồ biểu hiện ALFPm3. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen Rab7. Trình tự gen và amino acid suy diễn của Rab7. So sánh trình tự nucleotide ở gen Rab7 của tôm sú Việt Nam với trình tự đã công bố.

Mô phỏng cấu trúc bậc hai và phân tích các motif chức năng của protein Rab7. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn 5‟-syntenin.62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn của đoạn 5‟-syntenin. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng gen syntenin.64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.vn xi Hình 3.

Trình tự gen và amino acid suy diễn của syntenin. So sánh trình tự amino acid của protein syntenin giữa các loài khác nhau. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại và tách dòng đoạn 5‟-hemocyanin.