Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp
Luận án: Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp. Xem tóm tắt và tải về tại LuanAn.net
Năm xuất bản
Số trang
148
Thời gian đọc
23 phút
Lượt xem
1
Lượt tải
0
Phí lưu trữ
40 Point
Tổng quan nhanh
- Chủ đề:
- Nghiên cứu Công nghệ Sản xuất Insulin Tái tổ hợp
- Số trang:
- 148 trang
- Trường:
- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
- Chuyên ngành:
- Vi sinh học
- Tác giả:
- Hoàng Văn Quốc Chương
- Năm:
- 2010
Tóm tắt nội dung luận án
I.Nghiên cứu Công nghệ Sản xuất Insulin Tái tổ hợp
Luận án tập trung vào công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp. Insulin là hormone thiết yếu điều hòa đường huyết. Bệnh tiểu đường, một vấn đề sức khỏe toàn cầu, đòi hỏi nguồn cung cấp insulin ổn định. Trước đây, insulin được chiết xuất từ động vật. Phương pháp này có nhiều hạn chế về nguồn cung, chi phí, và nguy cơ miễn dịch. Kỹ thuật di truyền đã mở ra hướng mới. Nó cho phép sản xuất insulin người thông qua công nghệ sinh học. Công nghệ này đảm bảo nguồn cung dồi dào, an toàn hơn và tương thích sinh học cao. Nghiên cứu này đóng góp vào sự phát triển của quy trình sản xuất sinh dược phẩm. Mục tiêu là tối ưu hóa các bước quan trọng. Từ biểu hiện gen đến tinh sạch protein. Kết quả giúp giảm giá thành sản xuất. Đồng thời nâng cao chất lượng sản phẩm.
1.1. Mục tiêu và ý nghĩa nghiên cứu
Nghiên cứu hướng tới việc phát triển quy trình sản xuất insulin tái tổ hợp hiệu quả. Quy trình này sử dụng chủng E. coli làm hệ thống biểu hiện. Mục tiêu bao gồm thiết kế gen, tối ưu biểu hiện, và tinh sạch protein. Ý nghĩa nằm ở việc cung cấp giải pháp công nghệ. Nó góp phần vào khả năng tự chủ sản xuất thuốc điều trị tiểu đường. Nghiên cứu này cũng làm sâu sắc thêm kiến thức về kỹ thuật di truyền. Nó tăng cường hiểu biết về sản xuất protein tái tổ hợp. Sản phẩm insulin tái tổ hợp có hoạt tính sinh học cao. Nó đáp ứng nhu cầu điều trị cho bệnh nhân tiểu đường.
1.2. Tổng quan về insulin và tiểu đường
Insulin là một hormone peptide do tế bào beta tuyến tụy sản xuất. Nó đóng vai trò trung tâm trong chuyển hóa glucose. Thiếu hụt hoặc kháng insulin dẫn đến bệnh tiểu đường. Bệnh này gây ra nhiều biến chứng nghiêm trọng. Có hai loại tiểu đường chính: type 1 và type 2. Bệnh nhân tiểu đường type 1 cần insulin từ bên ngoài. Nhiều bệnh nhân tiểu đường type 2 cũng cần insulin. Nhu cầu về insulin ngày càng tăng trên toàn cầu. Việc sản xuất insulin tái tổ hợp là giải pháp tối ưu. Nó thay thế cho insulin động vật. Insulin tái tổ hợp có cấu trúc giống hệt insulin người.
II.Kỹ thuật Di truyền trong Biểu hiện Gen Insulin
Quá trình sản xuất insulin tái tổ hợp bắt đầu từ kỹ thuật di truyền. Gen mã hóa mini-proinsulin được thiết kế. Sau đó, nó được tổng hợp và đưa vào vi khuẩn. Đây là bước nền tảng cho việc biểu hiện protein. Việc lựa chọn vector biểu hiện phù hợp rất quan trọng. Vector mang gen mục tiêu vào tế bào chủ. E. coli là một trong những hệ thống biểu hiện được ưa chuộng. Nó có tốc độ tăng trưởng nhanh và chi phí thấp. Khả năng biểu hiện protein ở mức cao. Tuy nhiên, việc tối ưu hóa gen và vector là cần thiết. Điều này đảm bảo hiệu suất biểu hiện tối đa. Gen mini-proinsulin được ưu tiên. Nó là tiền chất đơn giản hơn proinsulin. Điều này giúp dễ dàng trong các bước xử lý sau.
2.1. Thiết kế và tổng hợp gen mini proinsulin
Gen mini-proinsulin được thiết kế đặc biệt. Nó mã hóa chuỗi proinsulin người nhưng bỏ đi một phần peptide C. Chuỗi mini-proinsulin chứa một chuỗi A và một chuỗi B. Chúng được nối với nhau bằng một đoạn peptide C ngắn hơn. Đoạn này dễ dàng loại bỏ sau này. Việc thiết kế này giúp tăng cường biểu hiện gen. Nó cũng cải thiện quá trình gấp cuộn protein. Gen được tổng hợp bằng phương pháp PCR tái tổ hợp. Đây là một phương pháp hiệu quả. Nó cho phép tạo ra các đoạn gen chính xác. Gen được gắn thêm một đoạn mã hóa 6xHis-tag. Điều này hỗ trợ quá trình tinh sạch sau này.
2.2. Tạo dòng gen vào vector biểu hiện
Gen mini-proinsulin sau khi tổng hợp được tạo dòng. Nó được đưa vào plasmid pBlue ban đầu (pBIns). Sau đó, gen được tái tạo dòng vào vector biểu hiện pET-43. Vector pET-43 là một hệ thống biểu hiện mạnh mẽ trong E. coli. Nó chứa promoter T7. Promoter này hoạt động hiệu quả khi được cảm ứng. Việc tạo dòng đúng cách đảm bảo gen được biểu hiện. Nó cho phép sản xuất protein mục tiêu. Quá trình này bao gồm cắt enzyme giới hạn và nối ligation. Cần kiểm tra trình tự gen để xác nhận. Trình tự gen phải chính xác sau khi tạo dòng.
2.3. Lựa chọn hệ thống biểu hiện E. coli
E. coli là lựa chọn phổ biến cho sản xuất protein tái tổ hợp. Nó có nhiều ưu điểm. Tốc độ tăng trưởng nhanh, dễ nuôi cấy, và năng suất cao. Các chủng E. coli đặc biệt được phát triển. Chúng hỗ trợ biểu hiện protein. Ví dụ, chủng E. coli BL21(DE3) thường được sử dụng. Chủng này chứa gen mã hóa RNA polymerase T7. Nó tương thích với vector pET. Tuy nhiên, E. coli cũng có nhược điểm. Nó không thực hiện được các sửa đổi sau dịch mã phức tạp. Insulin có thể tạo thành thể vùi trong E. coli. Việc xử lý thể vùi là một bước quan trọng.
III.Tối ưu Hệ thống Biểu hiện Protein Tái tổ hợp
Việc tối ưu hóa hệ thống biểu hiện là yếu tố then chốt. Nó quyết định năng suất và chất lượng protein tái tổ hợp. Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình này. Bao gồm lựa chọn vector, chủng vi khuẩn, và điều kiện cảm ứng. Hệ thống biểu hiện phải đảm bảo gen được phiên mã và dịch mã hiệu quả. Nó cũng cần giảm thiểu sự hình thành thể vùi không mong muốn. Mặc dù thể vùi là thách thức, chúng cũng là nguồn protein tập trung. Việc tối ưu hóa liên quan đến việc thử nghiệm nhiều điều kiện. Mục tiêu là đạt được lượng protein mục tiêu cao nhất. Đồng thời, giữ cho protein có khả năng gấp cuộn đúng cách. Điều này đặc biệt quan trọng với các sinh dược phẩm như insulin.
3.1. Các loại vector biểu hiện thường dùng
Nhiều hệ thống vector biểu hiện được sử dụng trong E. coli. Mỗi loại có đặc điểm riêng. Hệ thống pGEX tạo protein dung hợp với GST. Hệ thống pET tạo protein dung hợp với 6xHis-tag. Hệ thống pMAL tạo protein dung hợp với MBP. Hệ thống IMPACT tạo protein dung hợp với CBP. Vector pET-43 là một lựa chọn mạnh mẽ. Nó sử dụng promoter T7. Promoter này có hoạt tính cao. Protein dung hợp với His-tag rất phổ biến. Nó giúp việc tinh sạch trở nên đơn giản. Việc lựa chọn vector phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu. Nó cũng phụ thuộc vào đặc tính của protein mục tiêu.
3.2. Ảnh hưởng của điều kiện cảm ứng biểu hiện
Điều kiện cảm ứng biểu hiện ảnh hưởng lớn đến năng suất. Chất cảm ứng phổ biến là IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside). Nồng độ IPTG, thời gian cảm ứng và nhiệt độ đều quan trọng. Nồng độ IPTG quá cao có thể gây stress cho tế bào. Nó dẫn đến giảm năng suất hoặc hình thành thể vùi. Nhiệt độ thấp hơn (ví dụ 18-25°C) có thể giảm tốc độ tăng trưởng. Tuy nhiên, nó thường cải thiện quá trình gấp cuộn protein. Thời gian cảm ứng đủ dài để đạt mức biểu hiện tối đa. Tuy nhiên, quá lâu có thể gây suy thoái protein. Cần tối ưu từng yếu tố. Mục đích là đạt hiệu suất biểu hiện cao nhất.
3.3. Tối ưu chủng E. coli cho sản xuất
Việc lựa chọn chủng E. coli phù hợp là rất quan trọng. Các chủng khác nhau có khả năng biểu hiện khác nhau. Chủng E. coli BL21(DE3) là một ví dụ điển hình. Nó có khả năng biểu hiện protein T7 RNA polymerase. Điều này giúp tăng cường biểu hiện từ promoter T7. Ngoài ra, việc bổ sung các chaperone có thể hỗ trợ. Chúng giúp protein gấp cuộn đúng cách. Việc biến đổi gen các chủng E. coli cũng được nghiên cứu. Mục đích là để cải thiện khả năng biểu hiện. Nó giúp giảm sự hình thành thể vùi. Hoặc tăng cường ổn định protein. Quy trình tối ưu hóa này rất cần thiết. Nó nâng cao hiệu quả sản xuất protein tái tổ hợp.
IV.Quy trình Lên men Sinh học Insulin Tái tổ hợp
Quy trình lên men sinh học là giai đoạn sản xuất quy mô lớn. Nó chuyển hóa các tế bào vi khuẩn thành nhà máy sản xuất protein. Hiệu suất của bước này ảnh hưởng trực tiếp đến chi phí. Đồng thời, nó ảnh hưởng đến khả năng thương mại hóa sản phẩm. Các phương pháp lên men khác nhau được áp dụng. Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng. Lên men mẻ-bổ sung (fed-batch fermentation) là kỹ thuật phổ biến. Nó được dùng cho sản xuất protein tái tổ hợp. Kỹ thuật này giúp duy trì điều kiện tối ưu trong thời gian dài. Nó cho phép đạt mật độ tế bào cao. Từ đó, tăng năng suất sản phẩm. Việc kiểm soát chặt chẽ các yếu tố trong quá trình lên men là cần thiết. Nhiệt độ, pH, oxy hòa tan và nồng độ chất dinh dưỡng đều phải được theo dõi.
4.1. Đặc điểm các phương pháp lên men
Có ba phương pháp lên men chính: mẻ (batch), liên tục (continuous), và mẻ-bổ sung (fed-batch). Lên men mẻ là đơn giản nhất. Tất cả chất dinh dưỡng được thêm vào lúc đầu. Tuy nhiên, nó dễ bị ức chế do chất thải. Lên men liên tục duy trì trạng thái ổn định. Chất dinh dưỡng được thêm vào, sản phẩm được loại bỏ liên tục. Nhưng nó phức tạp hơn về kỹ thuật. Lên men mẻ-bổ sung là sự kết hợp. Chất dinh dưỡng được bổ sung theo thời gian. Điều này giúp kiểm soát tốc độ tăng trưởng. Nó ngăn chặn sự ức chế. Đồng thời, nó tối ưu hóa sản xuất protein tái tổ hợp. Phương pháp này thường đạt mật độ tế bào cao nhất.
4.2. Lên men mẻ bổ sung cho hiệu suất cao
Lên men mẻ-bổ sung được ưa chuộng cho sản xuất insulin tái tổ hợp. Phương pháp này cho phép duy trì mật độ tế bào E. coli rất cao. Việc kiểm soát tốc độ bổ sung cơ chất là chìa khóa. Nó giúp tránh hiện tượng chuyển hóa phụ. Từ đó, tăng cường hiệu quả sử dụng năng lượng. Mật độ tế bào cao dẫn đến năng suất protein cao. Điều này đặc biệt quan trọng với các sinh dược phẩm đắt tiền. Quy trình này đòi hỏi hệ thống bioreactor tiên tiến. Nó cần khả năng kiểm soát tự động. Các thông số như pH, nhiệt độ, oxy hòa tan được giữ ổn định. Việc này giúp tối ưu hóa điều kiện tăng trưởng và biểu hiện protein.
4.3. Các yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men
Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men mẻ-bổ sung. Nhiệt độ tối ưu thường dao động từ 30-37°C. pH cần được giữ ổn định trong khoảng 6.8-7.2. Oxy hòa tan là yếu tố quan trọng cho vi khuẩn hiếu khí E. coli. Nó cần được duy trì ở mức cao. Tốc độ khuấy và sục khí ảnh hưởng đến oxy hòa tan. Nồng độ cơ chất ban đầu và tốc độ bổ sung cũng quan trọng. Việc thiếu hụt chất dinh dưỡng có thể làm giảm năng suất. Ngược lại, quá nhiều có thể gây ức chế. Sự có mặt của các ion kim loại và chất bổ sung khác cũng ảnh hưởng. Cần điều chỉnh và tối ưu hóa các yếu tố này. Mục tiêu là đạt được hiệu suất và năng suất tốt nhất.
V.Thu nhận và Tinh sạch Protein Insulin Hiệu quả
Sau quá trình lên men, bước tiếp theo là thu nhận và tinh sạch protein. Insulin tái tổ hợp thường được biểu hiện dưới dạng thể vùi. Thể vùi là tập hợp các protein không gấp cuộn đúng cách. Việc xử lý thể vùi đòi hỏi các bước phức tạp. Bao gồm phá vỡ tế bào, hòa tan thể vùi, và tái gấp cuộn protein. Mục tiêu là chuyển protein từ dạng không hoạt động sang dạng có hoạt tính. Sau đó, insulin cần được tinh sạch đến độ tinh khiết cao. Nó phải đạt tiêu chuẩn dược phẩm. Các phương pháp sắc ký là công cụ chính. Chúng giúp loại bỏ các tạp chất. Đảm bảo sản phẩm cuối cùng an toàn và hiệu quả. Toàn bộ quy trình này là một thách thức lớn trong sản xuất sinh dược phẩm.
5.1. Thu nhận thể vùi mini proinsulin
Sau lên men, tế bào E. coli được thu hoạch bằng ly tâm. Tế bào được phá vỡ để giải phóng protein nội bào. Các phương pháp phá vỡ bao gồm siêu âm hoặc sử dụng áp lực cao. Thể vùi mini-proinsulin không hòa tan. Chúng sẽ được thu nhận thông qua ly tâm. Quá trình này giúp tách thể vùi ra khỏi các thành phần tế bào khác. Thể vùi sau đó được rửa sạch. Mục đích là loại bỏ các tạp chất còn lại. Thể vùi chứa protein mục tiêu ở nồng độ cao. Tuy nhiên, protein ở dạng này không có hoạt tính sinh học.
5.2. Tái gấp cuộn và cắt peptide C
Thể vùi được hòa tan trong dung dịch chaotropic mạnh. Ví dụ, urea hoặc guanidine hydrochloride. Sau đó, protein được tái gấp cuộn (refolding). Đây là bước quan trọng để protein lấy lại cấu trúc 3D có hoạt tính. Quá trình tái gấp cuộn thường được thực hiện từ từ. Nó có thể dùng phương pháp pha loãng hoặc thẩm tích. Sau khi tái gấp cuộn, mini-proinsulin được xử lý enzyme. Enzyme trypsin hoặc carboxypeptidase B được sử dụng. Chúng cắt bỏ đoạn peptide C ngắn. Kết quả là thu được insulin có hai chuỗi A và B. Các cầu disulfide cần được hình thành đúng cách để đảm bảo hoạt tính.
5.3. Các phương pháp tinh chế protein
Insulin thô sau tái gấp cuộn và cắt peptide C cần được tinh chế. Mục tiêu là đạt độ tinh khiết cao cho dược phẩm. Các phương pháp sắc ký được sử dụng rộng rãi. Sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, và sắc ký ái lực là các kỹ thuật chính. Sắc ký ái lực (ví dụ, sử dụng His-tag) là bước tinh sạch ban đầu hiệu quả. Sắc ký trao đổi ion phân tách protein dựa trên điện tích. Sắc ký lọc gel phân tách dựa trên kích thước. Các bước tinh chế trung gian và hoàn tất được thực hiện tuần tự. Mỗi bước loại bỏ một loại tạp chất. Quá trình này đảm bảo insulin cuối cùng có độ tinh khiết cao. Nó an toàn để sử dụng trong y tế.
VI.Triển vọng Ứng dụng Sản xuất Insulin Tái tổ hợp
Nghiên cứu về công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp có tầm quan trọng lớn. Nó không chỉ giải quyết nhu cầu y tế cấp bách. Mà còn mở ra nhiều triển vọng trong ngành công nghiệp sinh dược phẩm. Việc tối ưu hóa quy trình giúp giảm chi phí sản xuất. Nó làm tăng khả năng tiếp cận thuốc cho người bệnh. Thành công trong việc sản xuất mini-proinsulin và chuyển hóa thành insulin có hoạt tính. Điều này khẳng định tiềm năng của công nghệ sinh học Việt Nam. Nghiên cứu này đặt nền móng cho việc phát triển các dược phẩm sinh học khác. Nó góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành y tế. Đồng thời, nó nâng cao năng lực nghiên cứu và sản xuất trong nước.
6.1. Tiềm năng phát triển dược phẩm sinh học
Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp là một ví dụ điển hình. Nó cho thấy tiềm năng to lớn của kỹ thuật di truyền. Nó ứng dụng trong sản xuất dược phẩm sinh học. Ngoài insulin, nhiều protein điều trị khác cũng có thể được sản xuất. Ví dụ như hormone tăng trưởng, interferon, và kháng thể đơn dòng. Việc phát triển các quy trình hiệu quả. Nó giúp mở rộng danh mục thuốc sinh học. Điều này cung cấp nhiều lựa chọn điều trị hơn. Nó cũng giảm gánh nặng chi phí y tế. Ngành công nghiệp sinh dược phẩm đang phát triển mạnh mẽ. Nghiên cứu này đóng góp vào sự tăng trưởng đó.
6.2. Nâng cao hiệu quả quy trình công nghiệp
Các phát hiện từ luận án có thể được áp dụng vào quy mô công nghiệp. Việc tối ưu hóa các bước từ thiết kế gen đến tinh sạch. Nó giúp nâng cao hiệu quả tổng thể. Năng suất cao hơn và độ tinh khiết lớn hơn. Điều này trực tiếp ảnh hưởng đến tính kinh tế của sản phẩm. Việc sử dụng E. coli là một lựa chọn tiết kiệm chi phí. Nó so với các hệ thống biểu hiện phức tạp hơn. Quy trình sản xuất sinh dược phẩm được chuẩn hóa và tự động hóa. Điều này sẽ đảm bảo chất lượng đồng đều. Nó cũng giảm thiểu sai sót trong sản xuất.
6.3. Đóng góp vào y học và kinh tế
Việc sản xuất insulin tái tổ hợp trong nước. Nó có ý nghĩa quan trọng về mặt y học. Nó đảm bảo nguồn cung cấp thuốc ổn định cho bệnh nhân tiểu đường. Đồng thời, nó giảm sự phụ thuộc vào nhập khẩu. Về mặt kinh tế, nó tạo ra giá trị gia tăng. Nó thúc đẩy sự phát triển của ngành công nghệ sinh học trong nước. Nghiên cứu này cũng góp phần đào tạo nhân lực chất lượng cao. Nó phát triển đội ngũ chuyên gia trong lĩnh vực kỹ thuật di truyền. Đây là một bước tiến quan trọng. Nó nâng cao vị thế khoa học và công nghệ của Việt Nam.
Tải xuống file đầy đủ để xem toàn bộ nội dung
Tải đầy đủ (148 trang)Trích đoạn nội dung luận án
Tải xuống để đọc toàn bộÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC KHOA HOÏC TÖÏ NHIEÂN ♣♦♣ HOAØNG VAÊN QUOÁC CHÖÔNG NGHIEÂN CÖÙU COÂNG NGHEÄ SAÛN XUAÁT INSULIN TAÙI TOÅ HÔÏP LUAÄN AÙN TIEÁN SÓ SINH HOÏC Thaønh phoá Hoà Chí Minh - Naêm 2010 ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC KHOA HOÏC TÖÏ NHIEÂN ♣♦♣ HOAØNG VAÊN QUOÁC CHÖÔNG NGHIEÂN CÖÙU COÂNG NGHEÄ SAÛN XUAÁT INSULIN TAÙI TOÅ HÔÏP Chuyeân ngaønh: Vi sinh hoïc Maõ soá: 1.12 LUAÄN AÙN TIEÁN SÓ SINH HOÏC NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC: PGS. TRAÀN LINH THÖÔÙC Thaønh phoá Hoà Chí Minh - Naêm 2010 -i- LÔØI CAÛM ÔN Tröôùc tieân, em xin chaân thaønh gôûi lôøi caûm ôn saâu saéc nhaát ñeán Phoù giaùo sö, Tieán só Traàn Linh Thöôùc. Thaày ñaõ taän tuïy höôùng daãn, giuùp ñôõ em trong quaù trình hoïc taäp, taïo ñieàu kieän toát nhaát cho em ñeå hoaøn thaønh luaän aùn. Khoâng coù söï hoã trôï cuûa Thaày, em khoâng theå hoaøn thaønh ñöôïc luaän aùn naøy.
Xin traân troïng caûm ôn Thaày! Em xin caûm ôn PGS. Phaïm Thaønh Hoå, ñaõ thöôøng xuyeân quan taâm, ñoäng vieân vaø cung caáp nhöõng thoâng tin quí baùu cho em trong quaù trình hoïc taäp vaø thöïc hieän luaän aùn. Xin gôûi lôøi caûm ôn ñeán PGS. Phan Vaên Chi, Phoù vieän tröôûng Vieän khoa hoïc Coâng ngheä Vieät Nam, ñaõ giuùp ñôõ chuùng toâi phaân tích trình töï mini-proinsulin.
Xin caûm ôn TS. Peer Nobert Jorgensen, coâng ty Norvonordisk, Ñan Maïch, ñaõ cung caáp cho chuùng toâi caùc khaùng theå söû duïng trong quaù trình nghieân cöùu. Em xin gôûi lôøi caûm ôn ñeán taát caû quí Thaày Coâ trong Khoa sinh hoïc, Tröôøng Ñaïi hoïc khoa hoïc töï nhieân thaønh phoá Hoà Chí minh, ñaõ cung caáp cho em nhöõng kieán thöùc boå ích trong suoát quaù trình hoïc taäp ôû Tröôøng. Xin caûm ôn taát caû caùc baïn, caùc em trong phoøng thí nghieäm coâng ngheä sinh hoïc phaân töû (Lab A) ÑH KHTN tp HCM.
Caûm ôn caùc baïn Hoaøng, Trang, Thaûo, Trí… caûm ôn caùc em Nam, Nhung, Nghóa, Ñaït, Ñöùc, Traâm, Ngaân… ñaëc bieät caûm ôn Hoa, ñaõ giuùp ñôõ toâi raát nhieàu trong thôøi gian thöïc hieän luaän aùn. Khoâng coù söï giuùp ñôõ cuûa caùc baïn, caùc em, toâi khoâng theå hoaøn thaønh ñöôïc luaän aùn naøy. Caûm ôn baïn beø, ñoàng nghieäp ñaõ ñoäng vieân, hoã trôï toâi trong quaù trình thöïc hieän luaän aùn. Vaø treân heát, xin chaân thaønh caûm ôn gia ñình, ngöôøi thaân ñaõ ñoäng vieân, giuùp ñôõ toâi trong suoát quaù trình hoïc taäp.
Ñaëc bieät caûm ôn Vôï vaø caùc con ñaõ mang laïi cho toâi nieàm haïnh phuùc, söï yeân taâm trong quaù trình thöïc hieän luaän aùn. Tp Hoà Chí Minh, Thaùng 01 naêm 2010 Luaän aùn Tieán só Lôøi caûm ôn -ii- MUÏC LUÏC Trang LÔØI CAÛM ÔN. i DANH MUÏC CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT .vi DANH MUÏC HÌNH. viii DANH MUÏC BAÛNG .xi ÑAËT VAÁN ÑEÀ.
TOÅNG QUAN. Insulin vaø vai troø ñoái vôùi cô theå. Beänh tieåu ñöôøng. Caùc phöông phaùp saûn xuaát insulin.
Saûn xuaát insulin töø tuïy taïng ñoäng vaät. Saûn xuaát insulin ngöôøi baèng kyõ thuaät taùi toå hôïp DNA. Saûn xuaát protein taùi toå hôïp trong teá baøo E. Ñaëc ñieåm cuûa E.
coli trong saûn xuaát protein taùi toå hôïp. coli thöôøng duøng trong saûn xuaát protein taùi toå hôïp. Caùc heä thoáng vector bieåu hieän trong E. Heä thoáng pGEX bieåu hieän protein dung hôïp vôùi GST.
Heä thoáng pET bieåu hieän protein dung hôïp vôùi 6xHis. Heä thoáng bieåu hieän dung hôïp vôùi MBP - Heä thoáng pMAL. Heä thoáng IMPACT bieåu hieän protein dung hôïp vôùi CBP. Phöông phaùp leân men vi sinh vaät.
Caùc phöông phaùp leân men saûn xuaát protein taùi toå hôïp. Ñaëc ñieåm leân men meû. Ñaëc ñieåm leân men lieân tuïc. Ñaëc ñieåm leân men meû-boå sung.
Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán leân men meû-boå sung chuûng E. coli ñeå saûn xuaát protein taùi toå hôïp. Caùc böôùc xöû lyù sau leân men ñeå thu nhaän mini-proinsulin vaø insulin coù hoaït tính. Thu nhaän vaø laøm tan theå vuøi chöùa mini-proinsulin.
Taùi gaáp cuoän mini-proinsulin taùi toå hôïp. Caét loaïi ñoaïn peptide C ñeå thu nhaän insulin coù hoaït tính. Caùc böôùc xöû lyù ñeå thu nhaän protein muïc tieâu töø protein dung hôïp .44 Luaän aùn Tieán só Muïc luïc -iii- 1. Caùc phöông phaùp tinh cheá trung gian vaø tinh cheá hoaøn taát trong saûn xuaát insulin töø mini-proinsulin.
Qui trình saûn xuaát insulin taùi toå hôïp theo moâ hình mini-proinsulin. VAÄT LIEÄU - PHÖÔNG PHAÙP. Duïng cuï vaø thieát bò. Thieát bò chính duøng trong sinh hoïc phaân töû.
Thieát bò duøng trong thao taùc nuoâi caáy vi sinh. Thieát bò duøng cho tinh cheá protein. Thieát bò duøng xaùc ñònh haøm löôïng ñöôøng huyeát. Hoùa chaát vaø moâi tröôøng.
Moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh. Nguyeân vaät lieäu. Chuûng vi sinh vaät. Moài duøng cho toång hôïp gen, taïo doøng vaø giaûi trình töï.
Thang phaân töû löôïng duøng trong ñieän di. Caùc khaùng theå söû duïng cho Western Blot vaø ELISA. Phöông phaùp. Thieát keá, toång hôïp gen mpi maõ hoùa 6xHis-MPI trong E.
coli baèng phöông phaùp PCR taùi toå hôïp. Taïo doøng gen mpi trong plasmid pBlue (pBIns). Taùi taïo doøng gen mpi vaøo vector bieåu hieän pET-43. Caûm öùng bieåu hieän vaø xaùc nhaän söï bieåu hieän cuûa 6xHis-MPI.
Hoaït hoùa chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Khaûo saùt caùc ñieàu kieän caûm öùng toái öu söï bieåu hieän 6xHis-MPI cuûa chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins.
Khaûo saùt thay theá trypton baèng pepton trong moâi tröôøng LB nuoâi caáy E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Khaûo saùt söï bieåu hieän 6xHis-MPI cuûa chuûng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng LBp vaø LB.
Khaûo saùt ñieàu kieän nuoâi caáy E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins maät ñoä cao baèng phöông phaùp meû-boå sung ôû qui moâ phoøng thí nghieäm. Khaûo saùt ñieàu kieän leân men E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins baèng nuoâi caáy meû-boå sung ôû qui moâ pilot 30L.
Phöông phaùp thu sinh khoái vaø ñoàng nhaát teá baøo. Thu nhaän vaø laøm tan theå vuøi chöùa 6xHis-MPI. Thu nhaän vaø tinh cheá sô boä 6xHis-MPI baèng saéc kyù coät Ni-NTA. Phöông phaùp caét loaïi boû 6xHis baèng CNBr ñeå thu nhaän MPI.72 Luaän aùn Tieán só Muïc luïc -iv- 2.
Khaûo saùt caùc ñieàu kieän aûnh höôûng leân söï taùi gaáp cuoän cuûa MPI. Tuûa mini-proinsulin vaø insulin baèng ion keõm kim loaïi. Phöông phaùp xöû lyù MPI baèng trypsin/carboxypeptidase B ñeå thu nhaän insulin coù hoaït tính. Kieåm tra caáu hình cuûa MPI vaø insulin baèng phöông phaùp ELISA.
Phaân tích MPI vaø insulin baèng saéc kyù RP-HPLC. Giaûi trình töï amino acid cuûa MPI baèng khoái phoå. Phöông phaùp ñònh löôïng protein. Phöông phaùp xaùc ñònh tính hoaït tính cuûa insulin taùi toå hôïp.
KEÁT QUAÛ - BIEÄN LUAÄN. Taïo doøng teá baøo E. coli coù khaû naêng bieåu hieän mini-proinsulin dung hôïp vôùi 6xHis (6xHis-MPI). Toång hôïp gen mpi maõ hoùa mini-proinsulin bieåu hieän trong E.
Taïo doøng gen mpi vaøo plasmid pBlue. Taïo doøng teá baøo E. coli BL21(DE3)/pET43Ins bieåu hieän MPI ôû daïng dung hôïp 6xHis-MPI. Kieåm tra trình töï amino acid cuûa 6xHis-MPI.
coli BL21(DE3)/pET43Ins toång hôïp 6xHis-MPI taùi toå hôïp ôû qui moâ phoøng thí nghieäm vaø qui moâ pilot. Hoaït hoùa, nhaân gioáng vaø kieåm tra khaû naêng bieåu hieän 6xHis-MPI cuûa chuûng E. coli BL21(DE3)/pET43Ins. Khaûo saùt caùc ñieàu kieän bieåu hieän toái öu 6xHis-MPI cuûa E.
coli BL21(DE3)/pET43Ins. Xaùc ñònh ñieàu kieän nuoâi caáy maät ñoä cao chuûng E. coli BL21(DE3)/ pET43Ins ôû qui moâ phoøng thí nghieäm. coli BL21(DE3)/pET43Ins theo phöông thöùc meû- boå sung ôû qui moâ 30 L ñeå toång hôïp 6xHis-MPI.
Thu nhaän MPI coù caáu hình töï nhieân. Thu nhaän theå vuøi chöùa 6xHis-MPI. Thu nhaän 6xHis-MPI töø theå vuøi. Thu nhaän MPI töø 6xHis-MPI.
Thu nhaän insulin töø MPI. Taùi gaáp cuoän MPI. Caét loaïi peptide C baèng trypsin. Kieåm tra hoaït tính cuûa insulin taùi toå hôïp treân chuoät.
Sô ñoà qui trình coâng ngheä saûn xuaát insulin ôû qui moâ pilot .119 KEÁT LUAÄN - ÑEÀ NGHÒ.122 Luaän aùn Tieán só Muïc luïc -v- DANH MUÏC COÂNG TRÌNH ÑAÕ COÂNG BOÁ LIEÂN QUAN ÑEÁN LUAÄN AÙN .124 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO .132 Luaän aùn Tieán só Muïc luïc -1- ÑAËT VAÁN ÑEÀ “Theá kyû 21 laø theá kyû cuûa caùc beänh Noäi tieát vaø caùc Roái loaïn chuyeån hoùa maø ñieån hình laø beänh ñaùi thaùo ñöôøng (Beänh tieåu ñöôøng)”. Nhaän xeùt naøy cuûa nhoùm chuyeân gia veà döï baùo tình hình beänh taät cuûa Toå chöùc Y teá theá giôùi ñaõ ñang trôû thaønh hieän thöïc vôùi nhöõng con soá cuï theå. Theo Toå chöùc Y teá theá giôùi (WHO, 2008) [77], hieän nay treân toaøn theá giôùi coù khoaûng 180 trieäu ngöôøi maéc beänh tieåu ñöôøng vaø öôùc tính con soá naøy seõ taêng gaáp ñoâi vaøo naêm 2030, chieám khoaûng 5% daân soá theá giôùi. Ñaùng lo ngaïi hôn laø caùc bieán chöùng cuûa beänh, cöù 10 giaây coù moät ngöôøi töû vong do nguyeân nhaân ñaùi thaùo ñöôøng, cöù 30 giaây laïi coù moät ngöôøi ñaùi thaùo ñöôøng bò caét cuït chi vaø cöù moãi ngaøy coù 5000 ngöôøi maát khaû naêng nhìn do bieán chöùng maét cuûa beänh.
Moãi naêm coù hôn 3,2 trieäu ngöôøi cheát vì caùc beänh lieân quan tôùi ñaùi thaùo ñöôøng töông ñöông vôùi soá ngöôøi töû vong vì beänh HIV/AIDS [1]. Beänh tieåu ñöôøng (BTÑ) ñang trôû thaønh gaùnh naëng cho moãi neàn kinh teá xaõ hoäi, maëc duø moãi naêm haøng nghìn tyû ñoâla Myõ ñöôïc chi phí cho ñieàu trò beänh, nhöng chöa bao giôø vaø seõ khoâng bao giôø nhöõng chi phí khoång loà veà kinh teá coù theå laáp ñaày ñöôïc nhöõng toån thaát, nhaát laø nhöõng maát maùt veà tinh thaàn do beänh taät gaây ra. Thöïc teá ñaùng lo ngaïi hôn laø tình traïng beänh xuaát hieän ngaøy caøng nhieàu töø lôùp treû [1]. ÔÛ Vieät Nam, tyû leä ngöôøi maéc BTÑ ngaøy caøng cao vaø ôû caùc thaønh phoá lôùn tyû leä naøy ñaõ taêng gaáp ñoâi töø 2% leân 4% trong 10 naêm giai ñoaïn 1990-2000.
Soá ngöôøi maéc BTÑ hieän nay khoaûng 4,5 trieäu ngöôøi, chieám 5,7% daân soá, trôû thaønh nöôùc coù toác ñoä phaùt trieån BTÑ nhanh nhaát theá giôùi [1]. Nguyeân nhaân cuûa BTÑ laø do thieáu insulin hoaëc do cô theå ngöôøi beänh khaùng insulin. Insulin laø moät polypeptide hormone ñöôïc sinh ra nhôø caùc teá baøo β cuûa tuyeán tuïy ñoäng vaät, coù vai troø ñieàu hoaø löôïng ñöôøng trong maùu. Phöông Luaän aùn Tieán só Ñaët vaán ñeà -2- phaùp ñieàu trò BTÑ phoå bieán hieän nay laø tieâm insulin ñònh kyø cho ngöôøi beänh.
Do soá löôïng ngöôøi maéc BTÑ ngaøy caøng cao neân nhu caàu söû duïng insulin caøng lôùn. ÔÛ chaâu AÂu, löôïng insulin ñaõ taêng leân 3 laàn trong voøng 12 naêm töø 1995-2007. Theo öôùc tính, nhu caàu insulin treân theá giôùi taêng töø khoaûng 5.000kg trong năm 2007 leân khoaûng 16.000kg vaøo naêm 2010, vôùi thò tröôøng döï tính khoaûng 11,8 tyû Myõ kim [41]. Naêm 1978, laàn ñaàu tieân caùc nhaø khoa hoïc cuûa coâng ty coâng ngheä sinh hoïc Genetech ñaõ doøng hoùa thaønh coâng gen maõ hoùa cho insulin ngöôøi vaøo vector bieåu hieän trong E.
Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ
Trích dẫn luận án này
Hoàng Văn Quốc Chương (2010). Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp [Luận án tiến sĩ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh]. LuanAn.net. https://luanan.net/tai-lieu-khac/luan-an-nghien-cuu-cong-nghe-san-xuat-insulin-tai-to-hop
Câu hỏi thường gặp
Luận án "Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp" nghiên cứu về vấn đề gì?
Luận án: Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp. Xem tóm tắt và tải về tại LuanAn.net
Luận án "Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp" được bảo vệ tại trường nào?
Luận án này được bảo vệ tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Năm bảo vệ: 2010.
Luận án "Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp" thuộc chuyên ngành gì?
Luận án "Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp" thuộc chuyên ngành Vi sinh học. Danh mục: Tài liệu khác.
Luận án "Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp" có bao nhiêu trang?
Luận án "Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp" có 148 trang. Bạn có thể xem trước một phần tài liệu ngay trên trang web trước khi tải về.
Cách tải luận án "Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp" về máy như thế nào?
Để tải luận án về máy, bạn nhấn nút "Tải xuống ngay" trên trang này, sau đó hoàn tất thanh toán phí lưu trữ. File sẽ được tải xuống ngay sau khi thanh toán thành công. Hỗ trợ qua Zalo: 0559 297 239.