Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo c

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HUỲNH VĂN CHƯƠNG KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62 64 01 02 Người hướng dẫn khoa học: 1. Đinh Thị Bích Lân 2. Nguyễn Hữu Nam NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017 Tác giả luận án Huỳnh Văn Chương i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy cô PGS. Đinh Thị Bích Lân, PGS. Nguyễn Hữu Nam đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Miễn dịch học và vắc xin, Viện Công nghệ sinh học - Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017 Nghiên cứu sinh Huỳnh Văn Chương ii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan. ii Mục lục .iii Danh mục chữ viết tắt.vii Danh mục bảng .viii Danh mục hình.

ix Danh mục biểu đồ. xi Danh mục đồ thị.xii Trích yếu luận án .xiii Thesis abstract. Tính cấp thiết của đề tài. Mục tiêu của đề tài.

Phạm vi nghiên cứu. Những đóng góp mới của đề tài. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Tổng quan tài liệu.

Giới thiệu về bệnh cầu trùng gà. Căn bệnh cầu trùng. Đặc điểm dịch tễ. Sinh bệnh học.

Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà bị bệnh cầu trùng. Các phương pháp chẩn đoán bệnh cầu trùng gà. Điều trị bệnh cầu trùng gà. Miễn dịch chống cầu trùng ở gà.

Vắc xin phòng bệnh cầu trùng gà. Tổng quan về công nghệ ADN tái tổ hợp. Giới thiệu chung về công nghệ ADN tái tổ hợp. Đặc điểm của hệ thống vector pET, pGEM-T Easy, tạo dòng và biểu hiện gene trong E.

Công nghệ chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng bằng phương pháp gây miễn dịch cho gà mái. Trọng lượng phân tử và tính chất lý hóa của IgY (Yolk Immunoglobulin). Cấu trúc của IgY. Độ bền của IgY.

Lợi thế của công nghệ sản xuất IgY. Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà. Những ứng dụng của IgY. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu.

Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu. Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu. Vật liệu nghiên cứu.

Thiết bị và hóa chất dùng cho nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Khảo sát các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà. Nghiên cứu tách dòng gene mã hóa kháng nguyên, tạo plasmid mang gene kháng nguyên, biến nạp vào tế bào E.

Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết và định lượng kháng nguyên tái tổ hợp. Kiểm tra độ tinh khiết và tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp. Nghiên cứu sản xuất bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể phòng trị bệnh. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và xác định bệnh tích đại thể, vi thể của gà mắc cầu trùng. Phương pháp xác định chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng. Phương pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh ở gà. Phương pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E.

Nghiên cứu tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên trong vector tạo dòng và biến nạp vào tế bào vật chủ E. Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E trong vector pET200/D-TOPO và biểu hiện gene kháng nguyên 3-1E. Phương pháp tách chiết tinh khiết, xác định tính đặc hiệu và định lượng của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp. Phương pháp chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà.

Phương pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị bệnh cầu trùng của chế phẩm. Phương pháp xử lý số liệu. Kết quả và thảo luận. Tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể, vi thể ở gà mắc cầu trùng.

Tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng gà nuôi tại huyện Phú Vang, Thừa Thiên Huế. Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi ở gà từ 1 đến 42 ngày tuổi. Triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng. Bệnh tích đại thể chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng.

Bệnh tích vi thể chủ yếu ở một số cơ quan của gà mắc bệnh cầu trùng. Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng. Một số chỉ tiêu hồng cầu ở gà từ 1-42 ngày tuổi mắc bệnh cầu trùng. Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu hệ bạch cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng (35-42 ngày tuổi).

Kết quả nghiên cứu hàm lượng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu trùng (35-42 ngày tuổi). Kết quả phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E. Thu và tinh sạch Oocyst cầu trùng gà. Xác định loài cầu trùng bằng phương pháp PCR.

Kết quả tách chiết ARN tổng số. Kết quả thực hiện PCR. Tinh sạch sản phẩm PCR. Kết quả nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene 3-1E.

Kết quả tạo dòng gene kháng nguyên 3-1E vào vector tách dòng. Phân tích trình tự gene 3-1E. Kết quả tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên 3-1E vào vector biểu hiện pET200/D-TOPO. Kết quả về tinh khiết và khả năng liên kết của kháng nguyên 3-1E cùng đuôi dung hợp 6His với cột Ni2+.

Tối ưu điều kiện biểu hiện của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp. Kết quả sinh trưởng của E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E. Kết quả về khảo sát đường cong sinh trưởng.

Kết quả về tỷ lệ tiếp giống tối ưu. Kết quả tốc độ lắc tối ưu lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn E. coli chủng BL21 (DE3). Kết quả về môi trường biểu hiện tối ưu.

Nồng độ tối ưu của chất cảm ứng IPTG. Thời gian cảm ứng của chất cảm ứng tối ưu. Nhiệt độ cảm ứng tối ưu. Mật độ tế bào tối ưu.

Tách chiết, tinh sạch, định lượng và xác định tính đặc hiệu của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp. Tách chiết, tinh sạch và định lượng kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E. Tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp. Chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà.

Xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch cho gà. Nghiên cứu lựa chọn tá chất gây miễn dịch cho gà. Định lượng kháng thể IgY. Xác định hiệu giá kháng thể trong chế phẩm lòng đỏ.

Đánh giá hiê ̣u quả phòng bệnh của chế phẩ m. Đánh giá hiê ̣u quả điề u tri ̣của chế phẩ m. Kết luận và kiến nghị. 90 Danh mục các công trình đã công bố.

91 Tài liệu tham khảo. 106 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Bp Base pair Cặp ba zơ BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid Sợi ADN bổ sung DNA Deoxyribonucleic acid Axít Deoxyribonucleic ELISA Enzyme - Linked ImmunoSorbent Assay Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzyme HI Hemagglutination inhibition Ức chế ngưng kết hồng cầu IgY Yolk Immunoglobulin Kháng thể long đỏ trứng IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside kDa Kilo dalton Kilo dalton NC Negative control Đối chứng âm OD Optical density Mật độ quang học PBS Phosphate buffer saline Dung dịch muối đệm phốt phát PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RIA Radioimmunoassay Phương pháp miễn dịch phóng xạ RT - PCR Reverse transcription polymerase chain Phản ứng chuỗi trùng hợp reaction phiên mã ngược SARS Severe acute respiratory syndrome Hội chứng viêm phổi cấp tính SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide Điện di trên gel polyacrylamide gel electrophoresis WSF Water soluble fraction Phần hòa tan trong nước vii DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 4. Tỷ lệ và cường độ nhiễm cầu trùng trên đàn gà tại một số xã của huyện Phú Vang. Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi của gà.

Triệu chứng lâm sàng ở gà mắc bệnh cầu trùng. Kết quả mổ khám gà bị mắc bệnh cầu trùng. Tần suất xuất hiện các giai đoạn phát triển của cầu trùng gà trên tiêu bản vi thể các cơ quan gà bệnh. Chỉ tiêu hồng cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng.

Chỉ tiêu hệ bạch cầu của gà mắc bệnh cầu trùng. Hàm lượng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu trùng. Tỷ lệ nhiễm các loài cầu trùng gây bệnh ở gà. Sinh trưởng của chủng E.

coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E ở các môi trường khác nhau. Sinh trưởng của chủng E. coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E ở các tỷ lệ tiếp giống khác nhau. Sinh trưởng của chủng E.

coli BL21 (DE3) mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E ở các tốc độ lắc khác nhau. Kết quả kiểm tra lượng kháng thể trong lòng đỏ trứng của gà được gây miễn dịch với kháng nguyên có bổ sung tá chất. So sánh tỷ lệ mắc bệnh cầu trùng ở gà đươ ̣c và không đươc̣ phòng bê ̣nh bằ ng kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E. So sánh tỷ lệ chế t ở gà đươ ̣c và không đươ ̣c phòng bê ̣nh bằ ng kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E.

So sánh sinh trưởng của gà đươc̣ /không đươ ̣c phòng bê ̣nh bằ ng kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E .