Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ diox

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- PHÙNG KHẮC HUY CHÚ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG Hà Nội, 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- PHÙNG KHẮC HUY CHÚ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG LOẠI MÀU THUỐC NHUỘM HOẠT TÍNH VÀ PHÂN HỦY CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN CỦA VI SINH VẬT SINH ENZYME LACCASE Chuyên ngành: Kỹ thuật môi trường Mã số: 9.20 LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS Đặng Thị Cẩm Hà Hà Nội, 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án tiến sỹ “Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộm hoạt tính và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin của vi sinh vật sinh enzyme laccase” là công trình nghiên cứu do chính tôi tự thực hiện. Các kết quả nghiên cứu trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Các trích dẫn sử dụng trong luận án đã được ghi rõ tên tác giả tài liệu tham khảo.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018 TÁC GIẢ LUẬN ÁN NCS Phùng Khắc Huy Chú Lời cảm ơn Để hoàn thành được luận án, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà, Phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người thầy đã tận tâm, tận tình và nhiệt thành đã hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện thuận lợi và kịp thời trong những lúc khó khăn, vất vả để giúp tôi thực hiện và hoàn thành luận án này. Tôi chân thành cảm ơn các đồng chí lãnh đạo, chỉ huy Binh chủng Hóa học; các đồng chí lãnh đạo, chỉ huy, các đồng chí, đồng nghiệp công tác tại Phòng Khoa học quân sự và Viện Hóa học - Môi trường quân sự, Bộ Tư lệnh Hóa học đã hết sức giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi và tối đa về mặt tinh thần và một phần vật chất cho tôi khi tôi tham gia học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình. Bên cạnh đó, để có thể hoàn thành được luận án này, tôi chân thành cảm ơn ThS Đào Thị Ngọc Ánh, ThS Lê Việt Hưng, ThS Nguyễn Hải Vân cùng toàn thể các đồng nghiệp trong phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường,Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, làm việc nhóm một cách có hiệu quả để thực hiện một số nội dung liên quan đến luận án. Để hoàn thành chương trình nghiên cứu sinh đến được đích cuối cùng, tôi chân thành cảm ơn lãnh đạo, các thầy, các cô và các anh chị phụ trách đào tạo của Học viện Khoa học và Công nghệ, đặc biệt là lãnh đạo, các thầy, cô của Viện Công nghệ môi trường, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình truyền đạt, chỉ dạy những kiến thức, kinh nghiệm và chia sẽ những khó khăn của bản thân tôi trong những năm tháng đã qua.

Hoàn thành được luận án nghiên cứu này, tôi đã liên tục nhận được sự động viên to lớn của gia đình, dòng họ và đặc biệt là của “đồng chí vợ” đã luôn ở bên, chủ động khắc phục mọi khó khăn của gia đình nhỏ bé của tôi để động viên và tạo điểu kiện thuận lợi nhất để tôi yên tâm hoàn thành chương trình đào tạo tiến sỹ này. Tôi rất cảm ơn sự động viên, khích lệ của các đồng nghiệp, bạn bè trong và ngoài đơn vị đã dành cho tôi. Luận án được thực hiện với sự tài trợ về kinh phí của Đề tài độc lập cấp Nhà nước: "Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gene, các enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin", Mã số DTDLCN.TS Đặng Thị Cẩm Hà làm chủ nhiệm Đề tài. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 NGHIÊN CỨU SINH Phùng Khắc Huy Chú MỤC LỤC Mục lục Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ và đồ thị MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1 4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Laccase, laccase-like và vi sinh vật sinh tổng hợp laccase, laccase-like 4 1. Giới thiệu chung về laccase 4 1. Cấu trúc phân tử của laccase 4 1. Cơ chế xúc tác của laccase 5 1.

Một số đặc tính sinh hóa của laccase 6 1. Vi sinh vật sinh tổng hợp laccase 7 1. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ 8 1. Khả năng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ có clo 12 1.

Giới thiệu về laccase-like 13 1. Đặc điểm ô nhiễm nước thải dệt nhuộm và công nghệ xử lý 17 1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm và nước thải dệt nhuộm 17 1. Đặc điểm chung của thuốc nhuộm 17 1.

Đặc điểm chủng của nước thải dệt nhuộm 18 1. Các phương pháp xử lý màu thuốc nhuộm 19 1. Phương pháp hóa lý 19 1. Phương pháp oxy hóa nâng cao 20 1.

Phương pháp sinh học 21 1. Hiện trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam và các công nghệ xử lý 26 1. Hiện trạng ô nhiễm 26 1. Công nghệ xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm 28 1.

Phương pháp phân hủy sinh học xử lý dioxin và các hợp chất hữu cơ 30 1. Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T, dioxin và các hợp chất tương tự bởi laccase 31 1. Phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T, dioxin và các hợp chất tương tự bởi nấm sinh 33 tổng hợp enzym ngoại bào CHƯƠNG 2 40 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2. Đối tượng nghiên cứu 40 2.

Vật liệu để phân lập vi sinh vật và các chủng nấm kế thừa 40 2. Đối tượng nghiên cứu xử lý 40 2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 41 2. Thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu 41 2.

Phương pháp nghiên cứu 42 2. Phân lập, nuôi cấy vi sinh vật 43 2. Phân lập chủng nấm 43 2. Phân lập xạ khuẩn 43 2.

Lựa chọn môi trường nuôi cấy để chủng nấm sinh tổng hợp laccase cao 43 2. Nuôi cấy xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase-like trên các nguồn chất hữu cơ 43 vòng thơm khác nhau 2. Phân loại vi sinh vật 44 2. Phân loại VSV theo hình thái khuẩn lạc 44 2.

Phân loại VSV theo phương pháp sinh học phân tử 44 2. Phương pháp hóa - sinh 45 2. Xác định hoạt tính laccase, laccase-like sử dụng ABTS 45 2. Tinh sạch, nhận diện protein của laccase, laccase-like 46 2.

Xác định đặc tính protein của laccase, laccase-like tinh sạch 48 2. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm 49 2. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like 49 2. Xác định khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi chủng nấm 51 2.

Xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 52 2. Thực nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng laccase thô 52 2. Thực nghiệm phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bằng chủng nấm sinh tổng hợp 54 laccase 2. Phương pháp phân tích để xác định khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 55 2.

Phương pháp xử lý số liệu 55 CHƯƠNG 3 57 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN 3. Phân lập, tuyển chọn và định tên chủng nấm và xạ khuẩn có khả năng 57 sinh tổng hợp laccase, laccase-like 3. Phân lập và lựa chọn để phân loại nấm đảm có hoạt tính laccase cao 57 3. Phân lập và phân loại xạ khuẩn có khả năng sinh trưởng trên môi trường 60 chứa chất diệt cỏ/dioxin và sinh tổng hợp laccase-like 3.

Phân lập xạ khuẩn 60 3. Phân loại chủng xạ khuẩn XKBHN1 và XKBiR929 61 3. Môi trường để chủng nấm, chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp laccase, laccase-like 64 3. Môi trường thích hợp để chủng nấm FBV40 sinh tổng hợp laccase 64 3.

Khả năng sinh tổng hợp laccase-like của XKBHN1 và XKBiR929 trên môi 65 trường chứa các chất hữu cơ clo khác nhau 3. Đặc điểm hóa-lý của laccase, laccase-like tinh sạch 68 3. Tinh sạch laccase của nấm đảm Rigidoporus sp. Tinh sạch laccase-like của xạ khuẩn Streptomycese sp.

Đặc tính hóa-lý của laccase và laccase-like tinh sạch 71 3. Các yếu tố ảnh hưởng đến laccase tinh sạch 71 3. Đặc điểm động học của laccase tinh sạch 78 3. Đặc tính hóa-lý của laccase thô 79 3.

Đặc tính hóa - lý của laccase-like tinh sạch 81 3. Loại màu thuốc nhuộm và phân hủy chất diệt cỏ chứa dioxin 84 3. Loại màu thuốc nhuộm bởi laccase, laccase-like 84 3. Loại màu thuốc nhuộm tổng hợp bởi laccase thô của chủng nấm FBV40 84 3.

Loại màu hoạt tính sử dụng trong quân đội bởi laccase thô 89 3. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi Lac1 tinh sạch 96 3. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính MN.FBN bởi laccase-like tinh sạch của 97 chủng xạ khuẩn XKBiR929 3. Loại màu thuốc nhuộm hoạt tính bởi Rigidoporus sp.

Khả năng loại màu một số thuốc nhuộm hoạt tính sử dụng để nhuộm vải 98 may quân trang 3. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN ở các nồng độ khác nhau 101 3. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt D-glucose 102 3. Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các loại đường khác nhau 103 3.

Loại màu thuốc nhuộm MN.FBN khi có mặt các nguồn nitơ khác nhau 106 3. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase và nấm sinh tổng hợp laccase 108 3. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi laccase thô 108 3. Phân huỷ chất diệt cỏ/dioxin bởi nấm sinh tổng hợp laccase 112 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 121 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN 123 ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO 124 PHỤ LỤC Danh mục các chữ viết tắt 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4,5-TCP 2,4,5-trichlorophenol 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2,4-DCP 2,4-dichlorophenol ABTS 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) BH Sân bay Biên Hòa CDD Chất diệt cỏ chứa dioxin CGK Chất gắn kết DBF Dibenzofuran DCĐ Dịch chiết đất DD Dibenzo-p-dioxin DBP Dibromophenol đtg Đồng tác giả HBT 1-Hydroxybenzotriazole HCHC Hợp chất hữu cơ LiP Lignin peroxidase LMCO Laccase multicopper oxidase MN.FBN Megafix navy FBN MnP Mangan peroxidase MR.EBR Megafix red EBR MT.BES Megafix turquoise BES MY.BES Megafix yellow BES MY.EG Megafix yellow EG MCDD Mono chlorodibenzo-p-dioxin NN.SG Nova navy SG NY.FN2R Nova yellow RN2R NY.S3R Nova yellow S3R NY1 acid red 299 NY5 acid blue 281 NY7 acid red 266 PAH Polycyclic Aromatic Hydrocacbon = hydrocacbon đa nhân PCB Polychlorinatedbiphenyl PCDDs Polychlorinated dibenzo-p-dioxin PCDFs Polychlorinated dibenzofuran POPs Các hợp chất hữu cơ khó phân hủy ppm Parts per million (mg/kg) ppt Parts per trillion (ng/kg) RBBR Remazol Brilliant Blue R TBP Tribromophenol VA Valli anilin ViO Violuric acid VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật Danh mục bảng Bảng Tên bảng Trang Ứng dụng của laccase trong phân hủy các hợp chất hữu cơ Bảng 1.