Luận án tiến sĩ nghiên cứu biểu hiện gen gmchi1a liên quan đến tổng hợp isoflavo

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ THỊ HỒNG TRANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI1A LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP ISOFLAVONE PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merill] Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu THÁI NGUYÊN - 2020 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS. Chu Hoàng Mậu. Các kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực và mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Một phần kết quả đã được công bố trên các tạp chí và hội nghị khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả, phần còn lại chưa ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các kết quả đã trình bày trong luận án. Thái Nguyên, tháng 6 năm 2020 TÁC GIẢ Lê Thị Hồng Trang ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS. Chu Hoàng Mậu, thầy đã định hướng và trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, động viên để tôi có được sự tự tin, khắc phục khó khăn và hoàn thành tốt bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.

Lê Văn Sơn và các cán bộ, nghiên cứu viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng và Phòng Công nghệ tế bào thực vật Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành một số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án. Được học tập và sinh hoạt chuyên môn tại Bộ môn Sinh học hiện đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tôi đã tích lũy được nhiều kiến thức và phương pháp nghiên cứu về các vấn đề của Sinh học hiện đại và công nghệ sinh học; đồng thời tôi đã nhận được nhiều đóng góp quý báu để tôi hoàn thành kế hoạch học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô và cán bộ trong bộ môn. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ Khoa Sinh học và Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này.

Tôi xin bày tỏ lòng tri ân và biết ơn sâu sắc tới thầy cô, gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ khó khăn trong suốt chặng đường học tập, nghiên cứu của tôi thời gian qua. Thái Nguyên, tháng 6 năm 2020 TÁC GIẢ Lê Thị Hồng Trang iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN.ii MỤC LỤC.iii DANH MỤC KÍ HIỆU, TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT.iv DANH MỤC BẢNG.v DANH MỤC HÌNH.vi DANH MỤC PHỤ LỤC.vii MỞ ĐẦU. Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu.

Những đóng góp mới của luận án. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. CÂY ĐẬU TƯƠNG VÀ ISOFLAVONE TRONG HẠT ĐẬU TƯƠNG.

Cây đậu tương. Sinh tổng hợp isoflavone và các enzyme tham gia trong con đường phenylpropanoid. ENZYME CHI VÀ GEN MÃ HÓA CHI. CHUYỂN GEN Ở ĐẬU TƯƠNG VÀ PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN GEN CHI.

Chuyển gen ở đậu tương thông qua Agrobacterium. Tiếp cận kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện các thành phần của hạt. Nghiên cứu biểu hiện gen CHI. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Các giống đậu tương sử dụng trong nghiên cứu. Các vector và chủng vi khuẩn. Các cặp mồi sử dụng cho PCR. Hóa chất và thiết bị.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nhóm phương pháp phân tích hàm lượng isoflavone. Nhóm phương pháp phân lập gen. Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen GmCHI1A.

Nhóm phương pháp phân tích hoạt động của vector chuyển gen trên cây thuốc lá. Nhóm phương pháp biến nạp và phân tích cây đậu tương chuyển gen. Xử lý dữ liệu sinh học. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU VÀ HOÀN THÀNH LUẬN ÁN.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmCHI1A PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG. Hàm lượng daidzein và genistein trong mầm hạt của một số giống đậu tương trồng phổ biến ở miền Bắc Việt Nam. Tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen GmCHI1A từ cây đậu tương.

Sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid của gen GmCHI1A. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT MANG GEN GmCHI1A. Tạo cấu trúc mang gen chuyển GmCHI1A. Tạo vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A.

tumefaciens CV58 chứa vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A. Phân tích hoạt động của vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A trên cây thuốc lá. PHÂN TÍCH BIỂU HIỆN GEN GmCHI1A TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN. Biến nạp cấu trúc pCB301_GmCHI1A vào đậu tương thông qua A.

Phân tích sự có mặt và sự hợp nhất của gen chuyển GmCHI1A trong cây đậu tương chuyển gen T0. Phân tích biểu hiện protein CHI1A tái tổ hợp bằng Western blot và ELISA. Phân tích hàm lượng daidzein và genistein của các dòng đậu tương chuyển gen. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Enzyme CHI và hoạt động của gen CHI. Cây mô hình trong nghiên cứu chức năng gen. Chuyển gen ở đậu tương và phân tích biểu hiện gen GmCHI1A.95 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.100 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.102 TÀI LIỆU THAM KHẢO. iv DANH MỤC KÍ HIỆU, TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt AS Acetosyringone BAP Benzylaminopurine Bp base pairs Cặp bazơ nitơ CCM Co-cultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy cDNA Complementary DNA DNA bổ sung CHI Chalcone isomerase Cs cộng sự CTAB Cetyltrimethyl ammonium bromide DFR Dihydroxyflavonol 4- reductase DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate ELISA Enzyme-linked Xét nghiệm ELISA immunosorbentassay GA3 Gibberellic acid GM Germination medium Môi trường nảy mầm GmCHI1A Glycine max chalcone Gen GmCHI1A của cây đậu isomerase 1A tương IAA Idole acetic acid IBA Idolbutylic acid IFS Isoflavone synthase Kb Kilo base kD Kilo Dalton L-Tyr L-tyrosine v Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt LB Luria Bertani Môi trường dinh dưỡng cơ bản nuôi cấy vi khuẩn mRNA Messenger ribonucleic RNA thông tin acid MS Murashige and Skoog Môi trường dinh dưỡng cơ medium bản nuôi cấy mô thực vật NAA Naphthaleneacetic acid OD Optical density Mật độ quang Ori Origin Điểm khởi đầu sao chép PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase RM Rooting medium Môi trường tạo rễ RNA Ribonucleic acid Rpm Revolutions per minute Số vòng/ phút scFv Single-chain fragment variable SDS Sodium dodecyl sulfate SEM Shoot elongation medium Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium Môi trường cảm ứng tạo chồi taq DNA Thermus aquaticus DNA polymerase polymerase T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA được chuyển Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid T0, T1 Các thế hệ cây chuyển gen T0 Cây chuyển gen tái sinh từ chồi trong ống nghiệm T1 Thế hệ thứ nhất vi Kí hiệu, viết tắt Tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt T2 Thế hệ thứ hai TL-DNA Transfer left -DNA Vùng biên trái đoạn DNA được chuyển TR-DNA Transfer right -DNA Vùng biên phải đoạn DNA được chuyển UV Ultraviolet Tia cực tím Vir Virus interferon Gen vir resistance WT Wild type Cây không chuyển gen X-gal 5-bromo-4-chloro-3- indolyl-β-D-galacto- pyranoside v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.

Thống kê các gen GmCHI phân lập từ cây đậu tương đã được công bố trên GenBank. Tóm tắt các gen được biến nạp vào đậu tương theo phương pháp gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Một số nghiên cứu biểu hiện gen CHI ở thực vật. Trình tự nucleotide của các cặp mồi sử dụng trong PCR và kích thước sản phẩm DNA dự kiến.

Thành phần phản ứng PCR với Master Mix. Thành phần phản ứng gắn gen GmCHI1A vào vector tách dòng. Hàm lượng isoflavone trong mầm 3 ngày tuổi của 5 giống đậu tương (mg/100g). Những vị trí sai khác về trình tự nucleotide của GmCHI1A giữa các giống đậu tương và trình tự gen GmCHI1A mang mã số NM_001248290.

Những vị trí sai khác về trình tự amino acid suy diễn của gen GmCHI1A giữa các giống đậu tương và trình tự gen mang mã số NM_001248290. Các trình tự gen GmCHI1A của các giống đậu tương Việt Nam và các trình tự có mã số trên GenBank được sử dụng trong phân tích. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen chuyển GmCHI1A vào thuốc lá. Kết quả biến nạp cấu trúc pCB301_GmCHI1A vào giống DT2008 nhờ A.

tumefaciens qua nách lá mầm. Hiệu suất chuyển gen GmCHI1A vào giống đậu tương DT2008 ở các giai đoạn phân tích. Sự thay đổi hàm lượng daidzein và genistein ở giai đoạn hạt nảy mầm của các dòng đậu tương chuyển gen so với các cây không chuyển gen.91 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1. So sánh về cấu trúc của chất chuyển hóa equol của isoflavone với estradiol của estrogen.

Một số dạng khác nhau của isoflavone. Con đường phenylpropanoid ở đậu tương. Cấu trúc cơ chất và đặc trưng của CHI loại I và CHI loại II tương ứng. Cấu trúc CHI với cơ chất (2S)-naringenin.

Cấu trúc CHI và phản ứng với (2S)-naringenin. Một phần con đường của flavonoid và isoflavonoid. Các gen GmCHI của đậu tương được nhóm thành 4 phân họ dựa trên cơ sở tương đồng và cơ chất đặc hiệu. Hạt của 5 giống đậu tương sử dụng trong nghiên cứu.

Sơ đồ tổng quát các thí nghiệm thực hiện trong luận án. Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A. Sắc ký đồ phân tích daidzein và genistein từ mầm hạt đậu tương ở giai đoạn nảy mầm 3 ngày tuổi. Biểu đồ so sánh hàm lượng daidzein và genistein trong hạt nảy mầm 3 ngày tuổi của các giống đậu tương ĐT51, ĐT26, DT90, DT2008, DT84.

Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmCHI1A. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR với cặp mồi pUC18F/pUC18R. Kết quả phân tích bằng BLAST trên NCBI trong nhận diện trình tự gen GmCHI1A phân lập từ giống đậu tương ĐT26. Trình tự gen GmCHI1A (cDNA) phân lập từ mRNA của bốn giống đậu tương ĐT26, ĐT51, DT2008, DT84.

NM_00124890: mã số của trình tự gen GmCHI1A trên GenBank. Trình tự amino acid suy diễn từ gen GmCHI1A của giống đậu tương ĐT26, ĐT51, DT84 và DT2008 so với NM_001248290. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên trình tự nucleotide của gen GmCHI1A được thiết lập theo phương pháp UPGMA. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các giống đậu tương dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GmCHI1A được thiết lập theo phương pháp UPGMA.

Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt mở vòng pRTRA7/3 và cắt pBT-GmCHI1A bằng cặp enzyme NcoI/NotI. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR nhân bản gen GmCHI1A từ các dòng khuẩn lạc. A: Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pRTRA7/3_GmCHI1A bằng HindIII. B: Sơ đồ cấu trúc và kích thước của đoạn CaMV35S_GmCHI1A_cmyc_ polyA thu nhận được.

Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm cắt plasmid pCB301. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301_GmCHI1A. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR nhân bản gen GmCHI1A từ khuẩn lạc E.coli tái tổ hợp.