Luận án tiến sĩ nghiên cứu nhân giống cây chanh dây passiflora edulis bằng kỹ th

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC **** TRẦN HIẾU NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY CHANH DÂY (Passiflora edulis) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO VÀ THỬ NGHIỆM TẠO CÂY VI GHÉP LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT HUẾ, 2021 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC **** TRẦN HIẾU NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY CHANH DÂY (Passiflora edulis) BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO VÀ THỬ NGHIỆM TẠO CÂY VI GHÉP Ngành: Sinh lý học thực vật Mã số: 9.12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. DƯƠNG TẤN NHỰT 2. CAO ĐĂNG NGUYÊN HUẾ, 2021 LỜI CẢM ƠN Khi tôi chập chững bước những bước chân đầu tiên vào con đường nghiên cứu khoa học, thì đó cũng chính là một chặng đường đầy khó khăn, gian nan và thách thức đối với tôi. Nhưng những bước chân chập chững này sẽ chẳng đi đến đâu nếu không có sự hỗ trợ, giúp đỡ và dìu dắt từ quý thầy, cô, anh, chị, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.

Đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn và dành những lời tri ân sâu sắc nhất đến thầy GS. Dương Tấn Nhựt. Thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Thầy không chỉ là một người thầy đơn thuần truyền thụ cho tôi những kiến thức chuyên môn quý báu, say mê công việc và đam mê trong nghiên cứu khoa học mà còn dạy cho tôi những bài học về đạo đức làm người, nhân cách sống.

Thầy là một tấm gương sáng cho thế hệ trẻ của chúng tôi noi theo để trở thành những nhà khoa học thực thụ trong tương lai và giúp ích cho xã hội. Cũng xin gửi lời cảm ơn đến thầy PGS. Cao Đăng Nguyên, giảng viên trường Đại học Khoa học, Đại học Huế cùng phối hợp với thầy GS. Dương Tấn Nhựt hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Nhân dịp này, tôi cũng xin cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Khoa học, phòng đào tạo sau đại học trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, quý thầy cô khoa Sinh học đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Xin cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Cao đẳng Sư phạm Ninh Thuận và Ban Giám đốc Phân hiệu Ninh Thuận thuộc Trường Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh, nơi tôi đang công tác đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án. i Tiếp đến, tôi xin cảm ơn đến các anh, chị, em đang công tác cũng như đang thực tập tại Phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập.

Và cuối cùng, con xin dành những lời tri ân, lời chúc sức khỏe tốt đẹp nhất và sâu sắc nhất đến Má và Cô Sáu. Má là người đã tần tảo chăm lo và nuôi nấng con lớn khôn cho đến ngày hôm nay. Má luôn ở bên cạnh con, động viên và ủng hộ con. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong gia đình mình cũng như các cháu đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em để học tập và hoàn thành tốt luận án.

Anh cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến vợ và con trai, đã luôn ở bên cạnh, ủng hộ và giúp đỡ anh rất nhiều khi gặp khó khăn. Vợ luôn lo lắng, động viên khi anh chán nản trong công việc, buồn phiền trong cuộc sống. Ninh Thuận, tháng 09 năm 2021 Tác giả Trần Hiếu ii LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan nghiên cứu “Nghiên cứu nhân giống cây chanh dây (Passiflora edulis) bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào và thử nghiệm tạo cây vi ghép” là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS. Dương Tấn Nhựt và PGS.

Cao Đăng Nguyên. Những kết quả nghiên cứu của người khác và các số liệu được trích dẫn trong luận án đều được chú thích đầy đủ. Đề tài được hỗ trợ bởi Phòng Sinh học phân tử và Chọn tạo giống cây trồng - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trong luận án là hoàn toàn trung thực.

Tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước nhà trường về sự cam đoan này. Ninh Thuận, tháng 09 năm 2021 Tác giả Trần Hiếu iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ¼ MS : Môi trường MS giảm một phần tư khoáng đa lượng ½ MS : Môi trường MS giảm một phần hai khoáng đa lượng ½ MSM : Môi trường cải biên MSM giảm một phần hai khoáng đa lượng ¾ MS : Môi trường MS giảm ba phần tư khoáng đa lượng B : Blue light; LED xanh dương BA : 6-benzyladenine CĐHST : Chất điều hòa sinh trưởng DNA : Deoxyribonucleic acid FL : Flourescent Lamp; ánh sáng đèn huỳnh quang IBA : Indole-3-butyric acid Kin : Kinetin LED : Light-Emitting Diode; ánh sáng LED lTCL : Longitudinal thin cell layer; lớp mỏng tế bào cắt theo chiều dọc lTCL-L : Mẫu lá cắt lớp mỏng theo chiều dọc lTCL-T : Mẫu đoạn thân cắt lớp mỏng theo chiều dọc iv MS : Môi trường Murashige và Skoog, 1962 MSM : Môi trường cải biên Monteri và cs, 2000 NAA : α- Naphthalene acetic acid PGRs : Plant growth regulators, các chất điều hoà sinh trưởng thực vật R : Red light; LED đỏ RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse transcriptase-PCR SPAD : Soil Plant Analysis Development; chỉ số chlorophyll TCL : Thin cell layer; lớp mỏng tế bào tTCL : Transverse thin cell layer; lớp mỏng tế bào cắt theo chiều ngang tTCL-L : Mẫu lá cắt lớp mỏng theo chiều ngang tTCL-T : Mẫu đoạn thân cắt lớp mỏng theo chiều ngang v MỤC LỤC Lời cảm ơn. i Lời cam đoan. iii Danh mục chữ viết tắt.

iv Mục lục. vi Danh mục các hình. xi Danh mục các bảng. xv MỞ ĐẦU.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. SƠ LƢỢC VỀ CÂY CHANH DÂY. Phân loại, nguồn gốc và phân bố. Hình thái và đặc tính sinh học cây chanh dây.

Một số virus gây bệnh thƣờng gặp ở chanh dây. Các thành phần dinh dƣỡng trong quả chanh dây. Giá trị kinh tế. Tình hình trồng chanh dây ở Lâm Đồng.

Các phƣơng pháp nhân giống chanh dây. Phương pháp truyền thống. Phương pháp vi nhân giống. Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh.

Kỹ thuật vi ghép. KỸ THUẬT NUÔI CẤY LỚP MỎNG TẾ BÀO. Giới thiệu chung. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy TCL.

Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy TCL trên cây ăn quả và cây thân gỗ. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy TCL trên cây dược liệu. ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KHẢ NĂNG TÁI SINH, SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC VẬT. Ảnh hƣởng của mẫu cấy.

Vị trí và loại của mẫu cấy. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng thực vật. Ảnh hƣởng của ánh sáng. Ảnh hƣởng của AgNO3 và nano bạc (AgNPs).

Ảnh hƣởng của giá thể. Ảnh hƣởng của môi trƣờng khoáng. Sự thoáng khí và nồng độ CO2, O2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Vật liệu thực vật. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất. Thiết bị chiếu sáng .4 Môi trƣờng nuôi cấy. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU.

Nghiên cứu vi nhân giống cây chanh dây tím và vàng thông qua kỹ thuật nuôi cấy TCL. Nghiên cứu tạo cây chanh dây lai sinh dƣỡng giữa giống chanh dây tím và vàng bằng kỹ thuật vi ghép. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm.

Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng và nguồn mẫu lên sự tái sinh chồi in vitro giống chanh dây tím và vàng. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA riêng lẻ, kết hợp NAA lên khả năng tái sinh chồi từ TCL lá giống chanh dây tím và vàng. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA riêng lẻ, kết hợp NAA lên khả năng tái sinh chồi từ TCL đoạn thân giống chanh dây tím và vàng. Nghiên cứu ảnh hưởng vị trí của mẫu TCL lên khả năng tái sinh chồi giống chanh dây tím và vàng.

Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tái sinh chồi từ mẫu TCL giống chanh dây tím và vàng. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau lên khả năng tái sinh chồi từ mẫu TCL giống chanh dây tím và vàng. Nghiên cứu ảnh hưởng của AgNO3, AgNPs lên khả năng tái sinh chồi từ mẫu TCL giống chanh dây tím và vàng. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự nhân nhanh chồi (có nguồn gốc TCL) giống chanh dây tím và vàng 39 2.

Nghiên cứu ảnh hưởng của cytokinin (BA kết hợp Kin) lên sự nhân nhanh chồi (có nguồn gốc TCL) giống chanh dây tím và vàng. Nghiên cứu ảnh hưởng của bình nuôi cấy thoáng khí và không thoáng khí lên sự nhân nhanh chồi (có nguồn gốc TCL) giống chanh dây tím và vàng. Nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (NAA, IBA) lên khả năng hình thành rễ của chồi in vitro (có nguồn gốc TCL) và sinh trưởng ngoài vườn ươm của giống chanh dây tím và vàng. Nghiên cứu ảnh hưởng của ánh sáng LED lên chất lượng cây con in vitro (có nguồn gốc TCL) và sinh trưởng ngoài vườn ươm của giống chanh dây tím và vàng.

Tạo nguồn vật liệu chồi thông qua nuôi cấy mô phân sinh đỉnh. Vi ghép giống chanh dây tím và vàng có nguồn gốc từ nuôi cấy mô phân sinh đỉnh. Trồng thử nghiệm giống chanh dây vi ghép ngoài vườn ươm và đồng ruộng. Một số công thức tính khi thu nhận số liệu.

Phƣơng pháp xử lý thống kê. Phƣơng pháp giải phẫu hình thái. Phƣơng pháp kiểm tra virus dựa trên kỹ thuật Reverse transcriptase- PCR (RT-PCR). Thu mẫu và tách chiếc ribonucleic acid (RNA) tổng số.

Kiểm tra virus dựa trên kỹ thuật RT-PCR. ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY. Điều kiện nuôi cấy in vitro. Điều kiện nuôi cấy ngoài vƣờn ƣơm.

Điều kiện trồng và chăm sóc ngoài đồng ruộng. Chuẩn bị đất trồng. Kỹ thuật làm giàn. Kỹ thuật chăm sóc và bón phân.

ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. VI NHÂN GIỐNG CHANH DÂY TÍM VÀ VÀNG THÔNG QUA KỸ THUẬT NUÔI CẤY TCL. Tạo nguồn vật liệu in vitro dƣới ảnh hƣởng của điều kiện khử trùng và nguồn mẫu.

Tái sinh chồi in vitro. Ảnh hưởng của BA riêng lẻ, kết hợp NAA lên khả năng tái sinh chồi từ tTCL-L và lTCL-L .