Luận án tiến sĩ hoá học phân lập toxin có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN VŨ THIÊN PHÂN LẬP TOXIN CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU TỪ NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CÓ HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG TĂNG SINH TẾ BÀO UNG THƢ TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC TP.Hồ Chí Minh – 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- TRẦN VŨ THIÊN PHÂN LẬP TOXIN CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG ĐÔNG MÁU TỪ NỌC BÒ CẠP HETEROMETRUS LAOTICUS VÀ TOXIN CÓ HOẠT TÍNH GIẢM ĐAU, KHÁNG TĂNG SINH TẾ BÀO UNG THƢ TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã sỗ: 9 44 01 14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Hoàng Ngọc Anh 2. Phùng Văn Trung TP.Hồ Chí Minh – 2021 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của TSKH. Hoàng Ngọc Anh và TS.

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Trần Vũ Thiên ii LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc, sự cảm phục và kính trọng nhất tới TSKH.

Hoàng Ngọc Anh và TS. Phùng Văn Trung - những người Thầy đã tận tâm hướng dẫn khoa học, động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Tôi vô cùng biết ơn GS. Utkin Yuri Nikolaevich, Viện Sinh hóa hữu cơ mang tên Shemyakin-Ovchinnikov, Moskva, Viện Hàn lâm Khoa học Nga đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong việc xác định cấu trúc phân tử của các chất.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng cùng tập thể cán bộ của Viện đã quan tâm giúp đỡ và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ths.Dược sĩ Nguyễn Thị Thùy Trang – giảng viên bộ môn Dược Lý, trường Đại học Nguyễn Tất Thành, TS. Phạm Đình Chương – giảng viên bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Tôn Đức Thắng cùng các em Trần Thụy Trúc Vy, Trần Thái Đạt – sinh viên trường Đại học Tôn Đức Thắng, đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong việc thực hiện khảo sát các tác dụng dược lý của nọc bò cạp và nọc rắn cùng những góp ý quý báu trong việc thực hiện và hoàn thiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công nghệ, bộ phận đào tạo, phòng Quản lý tổng hợp đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Trường Đại học Trà Vinh và các đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Trần Vũ Thiên iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan…………………………………………………………………….ii Mục lục……………………………………………………………………….iii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt………………………………………….viii Danh mục các bảng……………………………………………………….xi Danh mục các hình vẽ, đồ thị………………………………………….………… …xiii MỞ ĐẦU……………………………………………………………………. Giới thiệu về bò cạp……………………………………………….

Giới thiệu chung về rắn……………………………………………………. Giới thiệu về rắn cạp nong………………………………………. Phân bố sinh thái………………………………………………………. Tình hình nghiên cứu về nọc bò cạp…………………………….

Tình hình nghiên cứu nọc bò cạp trên thế giới……………………. Tình hình nghiên cứu bò cạp ở Việt Nam……………………………… …. Tình hình nghiên cứu về nọc rắn…………………………………. Tình hình nghiên cứu về nọc rắn trên thế giới ………………………… ….

Những nghiên cứu về rắn cạp nong ở Việt Nam……. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM………… …. Đối tƣợng nghiên cứu……………………………………………………… …. Khảo sát và phân lập các chất có hoạt tính chống đông máu từ nọc bò cạp H.

Khảo sát và phân lập các chất có hoạt tính giảm đau, kháng tăng sinh tế bào ung thƣ từ nọc rắn cạp nong B. Thiết bị nghiên cứu………………………………………………………… …. Phƣơng pháp phân lập và xác định các toxin từ nọc bò cạp H. Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc bò cạp H.

Tách protein trong nọc bò cạp H. laoticus bằng sắc ký lọc gel trên cột với Sephadex G-50……………………………………………………. Phân tách phân đoạn 5 nọc bò cạp H. laoticus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC)………………………………………….

Khảo sát tác động của các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 nọc bò cạp H. laoticus lên quá trình đông – chảy máu………………………… …. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính chống đông máu. Phƣơng pháp phân lập và xác định các toxin từ nọc rắn cạp nong B.

Sơ đồ tách, làm sạch và xác định toxin từ nọc rắn cạp nong B. Tách protein trong nọc rắn cạp nong B. fasciatus bằng sắc ký lọc gel trên gel Superdex HR75. Khảo sát KLPT các phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B.

fasciatus bằng phƣơng pháp điện di…………………………………… …. Khảo sát tác dụng giảm đau……………………………………………. Khảo sát tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong B. fasciatus toàn phần và các phân đoạn.

Khảo sát tác dụng giảm đau trung ƣơng của nọc rắn cạp nong B. fasciatus toàn phần và các phân đoạn …………………………………. Tách các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn BF4 nọc rắn cạp nong B. fasciatus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC)………….

Khảo sát hoạt tính giảm đau của một số phân đoạn thứ cấp tách ra từ phân đoạn BF4………………. Phân tích thống kê kết quả thử hoạt tính giảm đau……………………. Phƣơng pháp xác định KLPT của protein có hoạt tính giảm đau………. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của nọc thô và các phân đoạn rắn cạp nong B.

fasciatus theo phƣơng pháp MTT……………………. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính gây độc tế bào. Xác định KLPT dựa trên MALDI TOF/TOF MS ………………. Xác định trình tự amino acid dựa trên LC-MS/MS.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BIỆN LUẬN……………. Kết quả về bò cạp H. Sắc ký lọc gel nọc bò cạp H. Tách phân đoạn 5 nọc bò cạp H.

laoticus bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) ………………………. Tác động của các phân đoạn thứ cấp của phân đoạn 5 nọc bò cạp H. laoticus lên quá trình đông - chảy máu………………………………. Làm sạch hợp chất có hoạt tính chống đông máu từ phân đoạn 5.

Làm sạch phân đoạn 5. Làm sạch phân đoạn 5. Hoạt tính chống đông máu của phân đoạn 5 và các hợp chất sạch: 5. Xác định cấu trúc các chất có hoạt tính chống đông máu (5.3) từ phân đoạn 5.22 bằng MS và NMR………….

Cấu trúc của toxin 5. Cấu trúc của toxin 5. Kết quả về rắn cạp nong B. Sắc ký lọc gel của nọc rắn cạp nong B.

Xác định KLPT của các phân đoạn tách từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus bằng phƣơng pháp điện di. Tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong B. fasciatus toàn phần và các phân đoạn………………….

Tác dụng giảm đau trung ƣơng của nọc rắn cạp nong B. fasciatus toàn phần và các phân đoạn…………………. Phân tách phân đoạn BF4 từ nọc rắn cạp nong B. fasciatus có hoạt vi tính giảm đau bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC)….

Hoạt tính giảm đau của một số phân đoạn thứ cấp của phân đoạn BF4. Giảm đau ngoại biên…………………………………. Giảm đau trung ƣơng…………………………………. Xác định KLPT của protein BF4.11 và protein BF4.12 có hoạt tính giảm đau……….

Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ của nọc rắn cạp nong B. Khả năng gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5). Khả năng gây độc tế bào ung thƣ phổi A549 của nọc thô (BF) và các phân đoạn (BF1 – BF5). Phân lập phân đoạn BF3 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (RP-HPLC).

Hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 và ung thƣ phổi A549 của các phân đoạn thứ cấp (BF3.4) từ phân đoạn BF3…. Khả năng gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 của các phân đoạn thứ cấp (BF3. Khả năng gây độc tế bào ung thƣ phổi A549 của các phân đoạn thứ cấp (BF3. Khả năng gây độc tế bào thƣờng HK2 ở ngƣời của nọc thô (BF), các phân đoạn (BF1 – BF5) và các phân đoạn thứ cấp (BF3.

Xác định cấu trúc bậc một (trình tự amino acid) của protein 3.3 có hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ vú MCF-7 và ung thƣ phổi A549…………. Xác định KLPT của BF3.3 dựa trên MALDI TOF/TOF MS. Xác định trình tự amino acid của protein 3.3 dựa trên LC- MS/MS……………………………………………………………………. 101 vii KIẾN NGHỊ…………………………………………………………….

103 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ XUẤT BẢN………………………………… .104 TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………….118 viii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Diễn giải 3FTx Three – Finger Toxin ADP Adenosine di phosphate aPTT Activated partial thromboplastin time Adenocarcinoma human alveolar basal A549 epithelial cells B. fasciatus Bungarus fasciatus Rắn cạp nong BF Bungarus fasciatus BF – CT Bungarus fasciatus Cytotoxin Bungarus fasciatus – L - amino acid BF – LAAO oxidase BFPA Bungarus fasciatus Phospholipase A2 Nọc rắn cạp nong toàn BFV Bungarus fasciatus venom phần (thô) Phân đoạn 1 đến 5 (sau BF1 - BF5 Fraction 1 – Fraction 5 khi chạy sắc ký lọc gel nọc rắn cạp nong) Phân đoạn thứ cấp 3.4 của phân đoạn BF3.4 3 (sau khi chạy sắc ký pha đảo nọc rắn cạp nong) Cell viability (% of control) Lƣợng tế bào sống (%) Concentration (µg/mL) Nồng độ (µg/mL) C Control Chứng Complete Dulbecco's Modified cDMEM Eagle Medium Da Daltons DMSO Dimethyl sulfoxide ĐC Standard drug Đối chứng ix EAC Ehrlich ascites carcinoma Nồng độ hiệu quả trung EC50 Half maximal effective concentration bình EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Electrospray ionization mass ESI-MS spectrometry FBS Fetal Bovine Serum FDA Food and Drug Administration H.