Luận án tiến sĩ nghiên cứu sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá fab

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị máu phục vụ cấp cứu điều trị (≈ 2% dân số) [40]; ngoài máu và các chế phẩm máu, chế phẩm huyết tương, còn phải kể đến các chế phẩm huyết thanh như: gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, anti-D globulin, antivenom [141],[147],[152].trong đó, huyết thanh kháng nọc rắn (antivenom) là loại chế phẩm rất quan trọng, đặc biệt trong điều trị rối loạn đông cầm máu do nhiễm độc nọc rắn họ Vipridae. Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi và đất nông nghiệp, bờ biển dài hơn 3000 km, Việt Nam có môi trường rất thuận lợi cho rắn độc phát triển. Phần lớn cư dân sinh sống, làm việc trong môi trường nông nghiệp, rừng núi, hải đảo.nguy cơ bị rắn độc cắn rất cao (> 30. Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết tương phải sử dụng trong điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế đã quan tâm chỉ đạo việc nghiên cứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) [6],[8].

Đến nay, đã có một số nghiên cứu rất thành công, góp phần cứu sống hàng ngàn bệnh nhân, giảm mạnh lượng máu và chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23]. Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến nay chúng ta vẫn đang thiếu trầm trọng nhiều loại HTKNR; hầu như ta chỉ có duy nhất hai loại HTKNR cho rắn hổ đất và rắn lục tre [8],[165],[166],[171]. Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc rắn theo vùng địa lý, mỗi quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho chính quốc gia mình (khuyến cáo của WHO) [141],[20],[6]. Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu, 2 điều trị rắn độc cắn, chúng ta rất cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR; đặc biệt là các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; trong các loài đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% các loài rắn độc họ rắn hổ (Elapidae) tại Việt Nam, là loài rắn độc có độc tính cực mạnh, gây tử vong rất cao (> 80% nếu không được cấp cứu điều trị kịp thời) [14].

Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam từ trước đến nay cho thấy: nước ta có hai loài rắn cạp nia thường gặp chủ yếu là rắn cạp nia nam (Bungrarus candidus) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus). Đây là hai loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” rất giống nhau, thoáng nhìn rất khó phân biệt. Hai loài rắn này khác nhau cả về độc tính nọc và biểu hiện lâm sàng, chẩn đoán rất dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu không có tác dụng chéo và cũng chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15]. Nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá cho cả hai loài rắn độc nguy hiểm nói trên là giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp nia cắn trong cả nước.

Để tăng tính an toàn của chế phẩm, dạng F(ab’)2 là tối ưu, đồng thời phải áp dụng các giải pháp kỹ thuật và kiểm soát chất lượng toàn diện để chế phẩm có thể đạt Tiêu chuẩn Quốc gia về HTKNR dùng cho người, theo Dược điển Việt Nam [9]. Với các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tƣơng ngựa; đánh giá chất lƣợng chế phẩm trong phòng thí nghiệm” được thực hiện, nhằm các mục tiêu sau: 1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa, đạt Tiêu chuẩn Quốc gia. Đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm.

3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. MỘT SỐ ĐIỂM CẦN CHÚ Ý VỀ MÁU VÀ HUYẾT TƢƠNG 1. Máu: Máu là mô lỏng màu đỏ lưu thông trong hệ thống tuần hoàn; tạo thành từ các tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu và phần huyết tương chứa protein, muối khoáng, nước.Máu chiếm 1/13 trọng lượng cơ thể (60-70 ml/kg); thể tích ở nam khoảng 5-6 lít, nữ 4,5-5 lít; tỷ trọng: 1. Máu động vật có vú cũng gồm HC, BC, TC, huyết tương,.

với chức năng cung cấp oxi, dinh dưỡng, đông cầm máu, bảo vệ cơ thể,.tương tự ở người. Huyết tƣơng: Là phần dịch lỏng thu được sau ly tâm hoặc để lắng tự nhiên máu đã chống đông. Thành phần chủ yếu của huyết tương là nước (92%), các protein hòa tan (albumin, globulin, fibrinogen.), đường, các yếu tố đông máu, các chất điện giải, vitamin, hormon, carbon dioxide. Protein huyết tương gồm: globulin miễn dịch, bổ thể, các yếu tố đông máu, các yếu tố enzyme, các protein liên kết với lipid, các protein vận chuyển.các thành phần này thay đổi trong bệnh lý.

Điện di protein, điện di miễn dịch sẽ tách được các thành phần protein. Mỗi protein huyết tương đều có điểm đẳng điện tương ứng với pH. Tính hòa tan của protein chịu ảnh hưởng của nhiệt độ và tính tan trong dung dịch muối. Khi cấu trúc protein thay đổi, độ hòa tan cũng thay đổi, tính chất sinh học có thể mất đi; các yếu tố gây biến tính protein là: nhiệt độ, acid, base, tia cực tím (làm đứt gãy liên kết peptid), sóng siêu âm (gây oxy hóa) [31],[163].

CÁC LOẠI CHẾ PHẨM MÁU VÀ CHẾ PHẨM HUYẾT TƢƠNG 1. Máu toàn phần: Máu toàn phần là máu lấy từ mạch máu người cho (hoặc động vật cho máu), bảo quản trong túi (hoặc chai, bình chuyên dụng) có chất chống đông và bảo quản máu (thông thường là CPDA gồm citrate, phosphat, đường dextrose, adenin). Mỗi đơn vị máu người cho khỏe mạnh (250 ml) có 30 - 40 gam hemoglobin [31],[170]. Bảo quản máu toàn phần ở nhiệt độ 2 - 6oC, thời gian bảo quản tối đa 42 ngày với dung dịch CPDA.

Máu toàn phần lưu trữ chứa thành phần chính là hồng cầu, máu mới thu nhận còn có tiểu cầu và một số yếu tố đông máu; bạch cầu đoạn nhanh chóng bị huỷ và giải phóng ra các chất trung gian; ngoài ra máu toàn phần còn chứa các bạch cầu lympho và các yếu tố huyết tương. Khối hồng cầu [31],[170]: Khối hồng cầu là máu toàn phần đã được ly tâm và tách phần huyết tương ở trên; tuỳ cách sản xuất mà có 5 loại khối hồng cầu sau: + Khối hồng cầu đậm đặc: là khối hồng cầu có hematocrit (Hct) khoảng 75%, gồm có: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một ít huyết tương; bảo quản ở nhiệt độ 2 - 6°C; là chế phẩm có tính đậm đặc nên phải truyền chậm. + Khối hồng cầu có dung dịch bảo quản: là khối hồng cầu sau khi tách huyết tương được trả lại dung dịch bảo quản; thành phần gồm có hồng cầu và dung dịch bảo quản, một ít bạch cầu, lượng huyết sắc tố tương tự máu toàn phần; bảo quản ở nhiệt độ 2 - 6°C, thời gian tối đa 42 ngày. + Khối hồng cầu nghèo bạch cầu: là chế phẩm máu được sản xuất từ máu toàn phần tách huyết tương và phần buffy coast; thành phần gồm có hồng cầu và khoảng 10% bạch cầu so với khối hồng cầu thông thường; có ưu điểm làm 5 giảm các phản ứng do bạch cầu, giảm các nguy cơ lây bệnh do tác nhân cư trú trong bạch cầu.

+ Khối hồng cầu rửa: là máu toàn phần hoặc khối hồng cầu được ly tâm bỏ hết huyết tương, sau đó thay thế bằng nước muối sinh lý NaCl 0,9% trộn đều, ly tâm tiếp để rửa ba lần; thành phần gồm có: hồng cầu + nước muối sinh lý; bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 6°C dưới 24 giờ, ở nhiệt độ 22°C dưới 6 giờ. + Khối hồng cầu lọc bạch cầu và khối hồng cầu chiếu xạ: là khối hồng cầu đã được dùng màng lọc bạch cầu hay tia xạ hoặc cả hai, bảo quản ở 2 - 6°C dưới hai tuần từ khi chiếu xạ. Nếu dùng màng lọc rời thì sau lọc không để quá 24 giờ. Thành phần chủ yếu là hồng cầu, còn rất ít bạch cầu, bạch cầu bị bất hoạt.

Như vậy: sau khi tách huyết tương, tùy điều kiện và nhu cầu truyền trả khối hồng cầu cho ngựa sớm hay muộn để quyết định sử dụng chống đông, dung dịch nuôi dưỡng hồng cầu và phương pháp bảo quản, vận chuyển trên đường đến nơi truyền trả khối hồng cầu ngựa. Nếu lấy máu ngựa vào các túi đôi, túi ba, dung tích 450ml, việc tách huyết tương và truyền trả khối hồng cầu ngựa sẽ đơn giản hơn lấy vào bình nhựa số lượng lớn (10 lít). Khối tiểu cầu: Tuỳ cách sản xuất, có hai loại khối tiểu cầu sau: + Khối tiểu cầu pool: là khối tiểu cầu được sản xuất bằng cách ly tâm các túi máu toàn phần, gạn lấy lớp buffy coast rồi ly tâm tách lấy tiểu cầu; thông thường từ 3 - 4 đơn vị máu toàn phần cùng nhóm ABO có thể sản xuất được một đơn vị pool tiểu cầu; khối tiểu cầu nếu chưa pool, được bảo quản ở 22°C, lắc liên tục, thời gian từ 3 - 5 ngày; nếu đã pool qua hệ thống hở: để ≤ 24 giờ; số lượng tiểu cầu/pool khoảng 1,5 x 1011. + Khối tiểu cầu máy: là khối tiểu cầu được sản xuất bằng máy tách tế bào lấy tiểu cầu từ một người cho, thành phần có ≥ 3,0 x 1011 tiểu cầu/đơn vị, có ít bạch cầu; bảo quản ở 22°C trong máy lắc liên tục, tối đa được 5 ngày.

Huyết tƣơng tƣơi đông lạnh: Huyết tương tươi đông lạnh là huyết tương tách từ máu toàn phần trong 6 giờ kể từ lúc lấy máu, bảo quản đông lạnh; thành phần có albumin, globulin miễn dịch, các yếu tố đông máu bền vững và yếu tố VIII còn khoảng 70%; lượng huyết tương tách từ một đơn vị máu (250 ml) thường ≈ 125 - 150 ml. Thường pool lượng huyết tương tươi của hai đơn vị máu toàn phần cùng nhóm, dung tích khoảng 250 - 300ml. Bảo quản ở nhiệt độ - 25°C/năm, bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn - 25°C trong hai năm [31],[170]. Khi sản xuất HTKNR, phải bảo quản huyết tương của nhiều đợt, được lấy trong nhiều thời điểm khác nhau, bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 25°C để tránh các biến tính của protein theo thời gian do nhiều yếu tố tác động bất lợi.

Tủa VIII (cryo): Để huyết tương tươi đông lạnh ở 4°C, huyết tương tan ra có một phần tủa, ly tâm thu nhận các tủa này đó là tủa lạnh yếu tố VIII (cryo); thành phần: cryo có khoảng 2 - 3 đơn vị yếu tố VIII /ml và yếu tố V, fibrinogen; trọng lượng phân tử yếu tố VIII khoảng 300 kD [164], lớn hơn trọng lượng phân tử IgG (150 kD) [16] và được tách ta trong phương pháp tủa Cohn ở Fraction I, loại bỏ phần này khi tách γ-globulin vì không cần thiết sử dụng.