Nghiên cứu điều kiện phân tích các sulfamit bằng phương pháp sắc ký luận án thạc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------- Bùi Minh Thái NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH CÁC SULFAMIT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 MỤC LỤC MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Quá trình sinh máu. Quá trình sinh máu.

Bệnh bạch cầu cấp. Khái niệm chung. Dịch tễ học. Các nguyên nhân gây bệnh.

Cơ chế bệnh sinh. Đặc điểm lâm sàng. Đặc điểm xét nghiệm. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về nhuộm hóa học tế bào.

Kỹ thuật nhuộm Periodic-Axit Schiff (PAS). Kỹ thuật nhuộm peroxidaza (PER). Kỹ thuật nhuộm sudan B. Kỹ thuật nhuộm esteraza.

Kỹ thuật nhuộm photphataza. Ứng dụng phương pháp nhuộm hóa học tế bào trong y học. Nghiên cứu trong nước về nhuộm hóa học tế bào. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Đối tượng nghiên cứu. Tiêu chuẩn lựa chọn. Tiêu chuẩn loại trừ. Phương pháp nghiên cứu.

Thiết kế nghiên cứu. Phương pháp thu thập mẫu và số liệu. Kỹ thuật nghiên cứu. Xử lý số liệu.

Biện pháp hạn chế sai số. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. Bệnh phẩm, dụng cụ, máy móc và hóa chất nghiên cứu. Quy trình nhuộm hóa học tế bào.

Đánh giá kết quả. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. Đặc điểm chung của nhóm bệnh nhân được nghiên cứu. Nhóm bạch cầu cấp dòng lympho.

Đặc điểm chung về nhóm bệnh bạch cầu cấp dòng Lympho. Phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng lympho sử dụng bộ kit nhuộm HICYTEC. Kết quả nhuộm photphataza axit bạch cầu xác định loại lympho T trên bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho. Nhóm bạch cầu cấp dòng tủy.

Phân nhóm bạch cầu cấp dòng tủy theo giới tính và tuổi. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy theo kết quả chẩn đoán tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương. Kết quả phân loại thể bệnh bạch cầu cấp dòng tuỷ bằng kit nhuộm HICYTEC. Mức độ phù hợp về chẩn đoán thể bệnh bạch cầu cấp dòng tủy bằng bộ kít HICYTEC và kết luận của viện Huyết học-Truyền máu TW.

Phân loại dòng tế bào bạch cầu cấp thể lai lympho - tủy (Lai L-T). Kết quả nhuộm photphataza kiềm bạch cầu. Kết quả nhuộm sắt trên mẫu tủy của bệnh nhân bạch cầu cấp tại Viện HH- TM trung ương. 70 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP.

71 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 72 MỞ ĐẦU Bệnh bạch cầu cấp là nhóm bệnh máu ác tính của hệ thống tạo máu với đặc trưng bởi sự tăng sinh và tích tụ tế bào non trong máu và tủy xương. Bạch cầu cấp được chia thành 2 nhóm là bạch cầu cấp dòng tủy và bạch cầu cấp dòng lympho. Bạch cầu cấp dòng tủy là kết quả của sự tích lũy tế bào non bất thường trong tủy xương.

Bạch cầu cấp dòng lympho là bệnh tăng sinh ác tính trong quá trình tạo máu dòng lympho. Những tế bào này lấn át sự sinh máu bình thường trong tủy xương, chúng có thể thoát ra ngoài máu ngoại vi và thâm nhiễm vào các cơ quan nội tạng [23]. Bệnh có các hội chứng: Thiếu máu, xuất huyết, nhiễm trùng và dẫn tới tử vong nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời. Vì vậy, việc xác định chính xác thể bệnh cũng như dòng tế bào bị ung thư có vai trò quyết định trong điều trị.

Hiện nay, việc phân loại dòng tế bào và thể bệnh bạch cầu cấp dựa trên một trong hai tiêu chuẩn là FAB và WHO. Tiêu chuẩn FAB do các nhà Huyết học Pháp-Anh-Mỹ đưa ra năm 1976 là tổng hợp kết quả hình thái học và hóa học tế bào, năm 1986 tiêu chuẩn này đã bổ sung thêm kết quả miễn dịch và di truyền [15, 17]. Nhuộm hóa học tế bào gồm 8 kỹ thuật: Periodic-Acid Schiff (PAS), sudan black (SD), peroxidaza (PER), esteraza đặc hiệu, esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF và không ức chế, photphataza kiềm và axit. Ưu điểm của phương pháp nhuộm hóa học tế bào: Rẻ tiền, giá thành chỉ bằng 1/4 so với phương pháp miễn dịch và bằng 1/10 so với phương pháp di truyền, không cần máy móc hiện đại, dễ triển khai.

Hiện nay, các bộ kít nhuộm có bán trên thị trường là các kít đơn, giá thành cao và có những nhược điểm: kỹ thuật nhuộm nằm nên có nhiều cặn, quy trình nhuộm khác nhau về thời gian, số bước nhuộm, hóa chất cố định khác nhau, bước tẩy màu của kỹ thuật nhuộm Sudan và Periodic - Acid Schiff khó đồng nhất, nhuộm nền thiếu tương phản, chất màu dễ hòa tan trong dầu soi kính nên khó hội chẩn tiêu bản nhiều lần. Tại Việt Nam, các thuốc thử hầu hết là tự pha kết hợp với các yếu điểm trên nên độ nhạy, độ đặc hiệu còn thấp. Theo Trần Ngọc Vũ và cộng sự (2014) tỷ lệ phù hợp chẩn đoán giữa hình thái học-hóa học tế bào và miễn dịch là 89,1%, giá trị dự báo đối với bệnh bạch cầu cấp dòng lympho là 88,88% và độ đặc 1 hiệu là 73,77% [25]. Theo tác giả Nguyễn Hữu Toàn thì việc phân loại dòng tế bào theo tiêu chuẩn FAB dựa trên phương pháp nhuộm hóa học vẫn cần phải có sự điều chỉnh tới 29,7% nhờ vào kỹ thuật miễn dịch và di truyền [19.

Hiện nay, tác giả Trần Văn Tính, Trung tâm Huyết học- Truyền máu, Bộ Công an đã nghiên cứu và chế tạo thành công kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC gồm 10 kỹ thuật: Giemsa, Periodic-Axit Schiff (PAS), Peroxidaza, Sudan B, Esteraza đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu, Esteraza không đặc hiệu ức chế bằng NaF, Photphataza kiềm, Photphataza axit, Perls. Bộ kít đã cơ bản khắc phục được các yếu điểm ở trên. Nhằm đánh giá giá trị sử dụng của bộ kít, tiến tới có thể thay thế hàng nhập ngoại, đề tài “Ứng dụng bộ kít nhuộm hóa học tế bào để phân loại bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB” là đề tài có ý nghĩa khoa học, thực tiễn, kinh tế - xã hội cấp thiết. Mục tiêu của đề tài là: Đánh giá sự phù hợp của bộ kít nhuộm hóa học tế bào trong phân loại dòng tế bào so với phương pháp hình thái học, miễn dịch học và di truyền trên những bệnh nhân bạch cầu cấp đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB (1986).

Nội dung nghiên cứu:  Thống kê đặc điểm bệnh bạch cầu cấp trên các bệnh nhân được chọc tủy lần đầu tại Viện Huyết học-Truyền máu trung ương.  Đánh giá tính phù hợp của phương pháp nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC 10 kỹ thuật so với phương pháp hình thái học, miễn dịch và di truyền trên các bệnh nhân đã được chẩn đoán thể bệnh theo tiêu chuẩn FAB.  Đánh giá giá trị của kít nhuộm hóa học tế bào đồng bộ HICYTEC, khi nhuộm photphataza kiềm, nhuộm photphataza axit bạch cầu, nhuộm Perls trên bệnh nhân bạch cầu cấp. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.

Quá trình sinh máu 1. Cơ quan sinh máu Cơ quan tạo máu bao gồm: tủy xương, tổ chức lympho (lách, hạch, tuyến ức) và tổ chức võng mô. Thời kì phôi thai, cơ quan tạo máu gồm có gan, lách, hạch. Sau khi sinh, quá trình tạo máu (hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu) chỉ xảy ra ở tủy đỏ của các xương.

Đến tuổi trưởng thành, quá trình sinh máu chỉ còn diễn ra tại đầu các xương dẹt, đầu xương đùi, xương cánh tay và một vài khu vực sinh máu ngoài tủy biệt hóa các dòng lympho T và B [6]. Quá trình sinh máu Hiện nay nhiều công trình đã chứng minh, các dòng tế bào máu được sinh ra từ tế bào gốc vạn năng. Quá trình biệt hóa qua nhiều giai đoạn và tùy theo sự kích thích đặc hiệu mà tế bào gốc vạn năng biệt hóa để tạo thành những tế bào có chức năng cần thiết [11]. Ba kích thích tố chính tạo máu gồm: Erythropoietin tạo hồng cầu, thrombopoietin tạo tiểu cầu và colony-stimulating factors cùng với interleukin (IL) kích thích tạo bạch cầu.

Quá trình sinh máu được điều hòa bởi yếu tố di truyền đặc biệt là các tế bào bị chết theo chương trình [13]. Bệnh bạch cầu cấp 1. Khái niệm chung Bệnh bạch cầu cấp là tình trạng bệnh lý cấp tính của tế bào sinh máu với đặc điểm chính là tăng số lượng bạch cầu bất thường ở cả trong tủy xương và ở ngoài máu ngoại vi, tủy xương có trên 30% tế bào non (blast) trong tổng số tế bào có nhân, phá hủy quá trình sinh máu bình thường trong tủy và xâm nhiễm vào các cơ quan [12]. Dịch tễ học  Theo công bố của Rebecca Siegel MPH và cộng sự (2015) trong năm 2014, ở Mỹ ghi nhận 6.250 ca mắc mới bệnh bạch cầu cấp dòng lympho.

Tỷ lệ nam (3.150) gần bằng nhau, số tử vong gây ra bởi bệnh này là 1.450 người [52]; 3  Tại Mỹ, hàng năm xuất hiện mới khoảng 2,2 trường hợp bạch cầu cấp dòng tủy trên 100.000 dân và có khoảng 3.000 trường hợp bạch cầu cấp dòng lympho mới trên toàn quốc [44];  Tại Việt Nam, tuy chưa có nghiên cứu nào tiến hành đầy đủ về dịch tễ học của bệnh bạch cầu cấp trên toàn quốc nhưng theo tổng kết tại Viện Huyết học-Truyền máu, Bệnh viện Bạch Mai thì thấy bệnh bạch cầu cấp gặp tỷ lệ cao nhất (32.1%) trong số các bệnh máu đến khám và điều trị tại Bệnh viện Bạch Mai [7].Các nguyên nhân gây bệnh Cho tới nay nguyên nhân gây bệnh chưa được sáng tỏ. Tuy nhiên qua nhiều nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố liên quan tới phát sinh bệnh:  Tia xạ: Những người tiếp xúc nhiều với tia ion hóa hay tia xạ thường có nguy cơ bị bạch cầu cấp;  Hóa chất: Những người nhiễm mạn tính benzen hay sử dụng hóa chất để chữa bệnh ác tính dễ mắc bệnh bạch cầu cấp;  Virus: Human T-cell lymphotropic virus gây bạch cầu cấp dòng lympho, Epstein-Barr virus (EBV) gây ung thư vòm.  Yếu tố di truyền: Những bệnh nhân bị một số bệnh di truyền như hội chứng Down, hội chứng Bloom, thiếu máu Fanconi có nguy cơ cao bị bạch cầu cấp [12]. Cơ chế bệnh sinh  Sự hoạt động của các gen ung thƣ (oncogene): Các gen bình thường do yếu tố nào đó tác động trở thành các gen bất thường gây ung thư gọi là gen ung thư.