Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá mú chấm cam epinephelus coioides hamilton 18

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THANH THÙY NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus Chuyên ngành : Nuôi trồng Thủy sản Mã ngành : 62 62 03 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. NGUYỄN HỮU DŨNG 2. WERGELAND KHÁNH HÒA - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ THANH THÙY NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ MÚ CHẤM CAM (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) NUÔI TẠI KHÁNH HÒA ĐỐI VỚI VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP KHÁNH HÒA - 2014 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu “ Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch ở cá mú chấm cam (Epinephelus coioides Hamilton, 1822) đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus” là kết quả nghiên cứu nghiêm túc của bản thân tôi trong suốt thời gian từ năm 2007-2012 dƣới sự hƣớng dẫn tận tình của Thầy Cô hƣớng dẫn. Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận án là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào.

Khánh Hòa, năm 2014 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Thanh Thùy ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nha Trang, Khoa Nuôi Trồng Thuỷ Sản, Khoa Sau Đại học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản III, Dự án “Mô hình hóa ven biển và quản lý sức khỏe cá- NUFUPRO 2007/10086” đã tạo mọi điều kiện thuận lợi về thời gian và hỗ trợ toàn bộ kinh phí cho tôi thực hiện luận án. Lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tôi muốn dành riêng cho hai Thầy Cô giáo hƣớng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Dũng và Giáo sƣ Heidrun I.

Wergeland đã định hƣớng nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Xin chân thành cảm ơn Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng và phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Bắc; Trung tâm quan trắc cảnh báo môi trƣờng và phòng ngừa dịch bệnh khu vực miền Nam đã cung cấp chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu này. Xin chân thành cảm ơn đến PGS.TS Đỗ Thị Hòa, TS. Lê Văn Bé, TS.

Phạm Quốc Hùng, TS. Đặng Thúy Bình, ThS. Nguyễn Thị Thoa đã sẵn lòng giúp đỡ, đóng góp ý kiến quý báu, chia sẻ kinh nghiệm và động viên tinh thần trong quá trình thực hiện luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các chuyên gia Phòng nghiên cứu miễn dịch - Khoa sinh học - Trƣờng đại học Bergen: TS.

Pettersen, NCS Anita Ronneseth và KS. Lovik đã tận tình hƣớng dẫn các kỹ thuật phân tích các thông số miễn dịch trong thời gian tôi thực hiện nghiên cứu tại Trƣờng Đại học Bergen, Nauy. Cuối cùng, tự đáy lòng cho phép tôi đƣợc bày tỏ tình cảm, lòng biết ơn sâu sắc nhất đến những ngƣời thân yêu của tôi: Má, anh chị, chồng tôi Nguyễn Văn Hùng và con gái Nguyễn Anh Thi đã luôn bên cạnh động viên khích lệ tinh thần cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn và tri ân tất cả tình cảm và sự giúp đỡ quý báu đó.

Khánh Hòa, năm 2014 Nguyễn Thị Thanh Thùy iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN.ii MỤC LỤC.iii DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT .vi DANH MỤC BẢNG. viii DANH MỤC HÌNH.ix MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Vài nét về đối tƣợng cá mú chấm cam Epinephelus coioides. Một số đặc điểm sinh học chủ yếu.

Nghề nuôi cá mú trên thế giới và tại Việt Nam. Một số bệnh thƣờng gặp ở cá mú nuôi. Vi khuẩn Vibrio và bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển. Vi khuẩn Vibrio.

Bệnh do vi khuẩn Vibrio gây ra trên cá biển. Đặc điểm hệ miễn dịch ở cá xƣơng. Miễn dịch tự nhiên. Miễn dịch đặc hiệu.

Các nhân tố ảnh hƣởng đáp ứng miễn dịch ở cá. Sử dụng vaccine và các chất kích thích miễn dịch trong nghề nuôi cá. Nghiên cứu ứng dụng các chất kích thích miễn dịch ở cá nuôi. Nghiên cứu và sử dụng vaccine ở cá nuôi.

Tình hình nghiên cứu miễn dịch và vaccine cho cá ở Việt Nam .36 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu. Thời gian nghiên cứu.

Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu chính của luận án. Phƣơng pháp nghiên cứu. Nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Nghiên cứu ảnh hƣởng của β-glucan đến đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở cá mú chấm cam.

Nghiên cứu đặc điểm phân tử kháng thể của cá mú chấm cam. Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Phƣơng pháp xử lý số liệu .56 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. Đặc điểm vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh lở loét ở cá mú chấm cam.

Bệnh xuất huyết lở loét ở cá mú chấm cam nuôi tại Khánh Hòa. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Độc lực của các chủng Vibrio parahaemolyticus V1, V2, V3 và A đối với cá mú chấm cam. Ảnh hƣởng của β-glucan đến các thông số miễn dịch không đặc hiệu và khả năng kháng bệnh do Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam.

Thành phần, đặc điểm hình thái và kích thƣớc các loại tế bào máu của cá mú chấm cam. Ảnh hƣởng của β-glucan đến thành phần bạch cầu trong máu của cá mú chấm cam. Ảnh hƣởng của β-glucan đến chỉ số thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam. Ảnh hƣởng của β-glucan đến hoạt tính bùng nổ hô hấp của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam.

Ảnh hƣởng của β-glucan đến khả năng kháng bệnh do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra ở cá mú chấm cam. Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu ở cá mú chấm cam đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Đặc điểm phân tử kháng thể IgM ở cá mú chấm cam. Đáp ứng tạo kháng thể ở cá mú chấm cam đối với 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất hoạt formalin không có FIA.

Đáp ứng miễn dịch dịch thể và khả năng kháng bệnh của cá mú chấm cam sau khi gây miễn dịch bằng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus V3 bất hoạt bằng formalin có bổ sung chất bổ trợ FIA .89 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .103 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 104 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN PHỤ LỤC vi DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ tiếng Anh Viết đầy đủ tiếng Việt (Nếu có) BA Blood agar base Môi trƣờng thạch máu BHI Brain Heart Infusion Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn CFU Colony Forming Unit Đơn vị tính khuẩn lạc vi khuẩn CMI Cell-Mediated Immunity Miễn dịch qua trung gian tế bào CRP C-reaction protein Protein phản ứng C DI Direct Immersion Ngâm trực tiếp ĐƢMD Đáp ứng miễn dịch FCA Freund’s complete Adjuvant Chất bổ trợ toàn phần Freund FIA Freund’s Incomplete Adjuvant Chất bổ trợ bán phần Freund HGNNV Humpback grouper nervous necrosis Loại virus gây hoại tử thần kinh ở cá mú virus lƣng gù HI Hyperosmotic Immersion Ngâm trong dung dịch ƣu trƣơng HRP Horseradish peroxidase i-ELISA indirect Enzyne Linked Kiểm định hấp phụ miễn dịch liên kết Immunosorbent Assay enzyme gián tiếp Ig Immunoglobulin globulin miễn dịch IgM Immunoglobulin M globulin miễn dịch lớp M IL-1 Interleukin 1 kDa Kilo Dalton Đơn vị tính khối lƣợng phân tử protein LD50 Lethal dose 50 Liều gây chết 50% LPS Lipopolysacharides MAC Membrane attacking complex Phức hợp tấn công màng MAM Multivalent Adhesion Molecule Phân tử gắn kết đa trị MHC II Major histocompatibility complex Phức hợp hòa hợp mô chủ yếu lớp II NB Nutrient Broth Môi trƣờng dinh dƣỡng dạng lỏng NCC Non-specific cytotoxic cell Tế bào độc không đặc hiệu NK Natural killer cell Tế bào diệt tự nhiên NTTS Nuôi trồng thủy sản vii OD Optical Density Mật độ quang OMP Outer Membrane Protein Protein ngoại mạc PA Phagocytosis activity Hoạt tính thực bào PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch đệm muối photphat RBA Respiratory burst activity Hoạt tính bùng nổ hô hấp RPS Relative Percent Survival Hệ số sinh tồn tƣơng đối RPP Relative Percent Protection Hệ số bảo vệ tƣơng đối SAP Serum Amyloid Protein Protein huyết thanh dạng sợi SDS- Sodium Dodecyl Sulfate - Điện di trên gel polyacrylamide có SDS PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis sIg Surface immunoglobuline Phân tử globulin miễn dịch bề mặt TCBS Thiosulphate citrate bile salt agar Môi trƣờng phân lập vi khuẩn Vibrio TDH Thermostable direct haemolysin Độc tố gây dung huyết bền nhiệt TLH Thermolabile haemolysin Độc tố gây dung huyết không bền nhiệt αTNF alpha Tumor Necrosis Factor Yếu tố anpha gây hoại tử khối u TNGB Tác nhân gây bệnh TSA Trypticase Soya Agar Môi trƣờng thạch dinh dƣỡng tổng hợp TSB Trypticase Soya Broth Môi trƣờng lỏng dinh dƣỡng tổng hợp TRH tdh-related hemolysin Độc tố gây dung huyết liên quan tdh Vibriosis Bệnh do vi khuẩn Vibrio VNN Viral Nervous Necrosis Bệnh hoại tử thần kinh do vi rút VSV Vi sinh vật viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Bệnh do vi khuẩn Vibrio trên cá mú nuôi.1: Đặc điểm hình thái, sinh hóa, sinh lý của 4 chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus.2: Kích thƣớc của các loại tế bào máu ở cá mú chấm cam Epinephelus coioides.3: Sự biến đổi tỷ lệ các loại bạch cầu trong máu ở cá mú chấm cam sau 2 tuần đƣợc cho ăn β-glucan .4: Hoạt tính thực bào của tế bào bạch cầu tiền thận cá mú chấm cam khi đƣợc bổ sung β-glucan vào thức ăn ở các nồng độ khác nhau.5: Tỷ lệ chết tích lũy và hệ số bảo hộ của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus bất hoạt bằng formalin đối với cá mú Epinephelus coioides .99 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides.2: Xu hƣớng sản lƣợng và giá trị cá mú trên thế giới .3: Sản lƣợng cá mú ở các quốc gia và vùng lãnh thổ nuôi chủ yếu .4: Đặc điểm cấu tạo màng tế bào vi khuẩn Vibrio .5: Vị trí và cấu tạo tuyến ức cá mú Epinephelus malabaricus .1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu .2: Hệ thống bể (a) và cá mú chấm cam thí nghiệm (b) .3: Các dụng cụ, thiết bị sử dụng phân lập bạch cầu .4: Các bƣớc khảo sát hoạt tính thực bào .1: Cá mú chấm cam Epinephelus coioides bị bệnh lở loét thu tại Khánh Hòa .2: Vibrio parahaemolyticus trên môi trƣờng thạch máu .3: Kết quả điện di trên gel agarose gen 16s rDNA của các chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus .