Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của cá chẽm con lates calcarifer bloch 1790 đối với

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ----------------------- TRẦN VĨ HÍCH NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM CON (Lates calcarifer Bloch 1790) ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus iniae LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP NHA TRANG – 2014 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ----------------------- TRẦN VĨ HÍCH NGHIÊN CỨU ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM CON (Lates calcarifer Bloch 1790) ĐỐI VỚI VI KHUẨN Streptococcus iniae Chuyên ngành: Nuôi trồng thủy sản Mã số: 62 62 03 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Dũng NHA TRANG – 2014 2 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. các kết quả thu được trong luận án này là kết quả nghiên cứu của dự án Bệnh ở cá chẽm, thuộc hợp phần II dự án SRV-2701 do Na Uy tài trợ mà tôi là một thành viên tham gia thực hiện dự án với tư cách là một nghiên cứu sinh theo kế hoạch hoạt động đào tạo của dự án. Tôi đã được Chủ nhiệm dự án cho phép sử dụng tất cả số liệu nghiên cứu được cho luận án tiến sĩ của mình.

Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào. NGHIÊN CỨU SINH Trần Vĩ Hích i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Khoa Nuôi trồng Thủy sản, Phòng Đào tạo Đại học và Sau Đại học, dự án SRV 2701 đã quan tâm giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu sinh. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Tiến sĩ Nguyễn Hữu Dũng, người đã định hướng nghiên cứu và trực tiếp khuyên bảo và giúp đỡ, giải quyết những khó khăn cả về vật chất lẫn tinh thần trong suốt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi hiểu rõ hơn về giá trị của nghiên cứu khoa học. Xin cám ơn Phó Giáo sư Tiến sĩ Đỗ Thị Hòa, người đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu chập chững trên con đường nghiên cứu khoa học và không ngừng dõi theo từng bước chân của tôi.

Chính Cô và Phó Giáo sư Tiến sĩ Nguyễn Đình Mão là những người đã tạo cơ hội cho tôi trở lại con đường nghiên cứu khoa học. Cho phép tôi kính gửi lòng biết ơn chân thành đến Giáo sư Heidrun Inger Wergeland, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian học tập phương pháp phân tích mẫu tại Na Uy và giúp đỡ tôi trong việc công bố công trình nghiên cứu trên tạp chí quốc tế. Xin cám ơn Tiến sĩ Lại Văn Hùng và Tiến sĩ Lục Minh Diệp, những người luôn tin tưởng và động viên tôi trong nghiên cứu khoa học cũng như giúp đỡ về vật chất trong thời gian đầu của quá trình nghiên cứu. Cám ơn Tiến sĩ Lê Minh Hoàng, Nghiên cứu sinh Đinh Văn Khương và Thạc sĩ Vũ Đặng Hạ Quyên luôn kịp thời cung cấp các bài báo khoa học trong quá trình nghiên cứu.

Xin chân thành cám ơn sự động viên, khích lệ và giúp đỡ của các Thầy, Cô giáo trong Khoa Nuôi trồng Thủy sản, cảm ơn các em sinh viên ngành Bệnh học thủy sản các khóa từ 46BH đến 50BH đã cùng tôi thực hiện nghiên cứu này. Lời cảm ơn cuối cùng tôi xin được giành cho gia đình của tôi: Ba, má, các anh chị, vợ và con tôi, những người đã luôn yêu thương, nâng đỡ tôi về vật chất lẫn tinh thần mà từ bao lâu nay tôi vẫn chưa nói ra một lời cám ơn. ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CÁM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1.1 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ TÌNH HÌNH NUÔI CÁ CHẼM 4 1.1 Một số đặc điểm sinh học của cá chẽm.2 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới 5 1.1 Sản lượng cá chẽm nuôi trên thế giới 5 1.2 Các hình thức nuôi cá chẽm thương phẩm 6 1.3 Tình hình nuôi cá chẽm tại Việt Nam 7 1.4 Các bệnh thường gặp ở cá chẽm nuôi 7 1.1 Bệnh do virus 7 1.2 Bệnh do vi khuẩn 8 1.3 Bệnh do kí sinh trùng 10 1.2 BỆNH DO Streptococcus iniae TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 11 1.1 Tình hình dịch bệnh Streptococcus iniae trong nuôi trồng thủy sản 11 1.2 Dấu hiệu bên ngoài của bệnh do Streptococcus inae 13 1.3 Giải phẫu bệnh lý cá nhiễm Streptococcus iniae 13 1.4 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn S.5 Biện pháp phòng và trị bệnh do Streptococcus iniae 16 1.3 HỆ THỐNG MIỄN DỊCH Ở CÁ XƯƠNG 20 1.1 Miễn dịch tự nhiên 20 1.1 Hàng rào vật lý và hóa học 20 iii 1.2 Hàng rào tế bào 21 1.3 Hàng rào thể dịch 22 1.2 Đáp ứng miễn dịch thích ứng 24 1.1 Hàng rào tế bào trong đáp ứng miễn dịch thích ứng 24 1.2 Hàng rào thể dịch trong đáp ứng miễn dịch thích ứng 25 1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch của cá 27 1.1 Các yếu tố ngoại cảnh 27 1.2 Các yếu tố nội tại 28 1.3 Các yếu tố phái sinh 28 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 34 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU.3 SƠ ĐỒ KHỐI NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (Hình 2.4 PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHÂN TÍCH MẪU 34 2.1 Phân lập và xác định đặc điểm vi khuẩn Streptococcus iniae.1 Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 34 2.2 Xác định độc lực của vi khuẩn phân lập 37 2.3 Kiểm tra độ nhạy kháng sinh của các chủng S.

iniae phân lập 38 2.4 Nghiên cứu phương thức xâm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm 38 2.5 Tính tương đồng kháng nguyên của các chủng phân lập 39 2.2 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của các chẽm đối với vi khuẩn S.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae và ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch này.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với tế bào vi khuẩn S. iniae bất hoạt bằng formalin (Formalin Killed Cell - FKC) 43 2.3 Nghiên cứu sự hình thành và phát triển tuyến ức của cá chẽm 49 2.4 Phương pháp phân tích số liệu 49 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 50 iv 3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN Streptococcus iniae PHÂN LẬP TỪ CÁ CHẼM 50 3.1 Phân lập vi khuẩn S. iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 50 3.1 Tình hình dịch bệnh do S.

iniae gây ra ở cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 50 3.2 Đặc điểm phân loại của các chủng vi khuẩn phân lập 52 3.2 Độc lực của vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá bệnh 54 3. iniae với các loại kháng sinh 57 3.4 Con đường cảm nhiễm của vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm 59 3.5 Tính tương đồng kháng nguyên của các chủng vi khuẩn gây bệnh đã phân lập 62 3.2 ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ CHẼM ĐỐI VỚI VI KHUẨN S.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm đối với vi khuẩn S. iniae bất hoạt và ảnh hưởng của β-glucan đến đáp ứng này 64 3.1 Hoạt tính thực bào và chỉ số thực bào 64 3.2 Nồng độ lysozyme trong huyết thanh của cá chẽm 66 3.3 Khả năng ức chế vi khuẩn S.

iniae của huyết thanh cá chẽm 67 3.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm đối với tế bào vi khuẩn S. iniae bất hoạt bằng formalin (FKC) 70 3.1 Biến động hàm lượng kháng thể đặc hiệu trong máu cá thí nghiệm sau khi tiêm FKC 70 3.2 Đặc điểm protein kháng nguyên của vi khuẩn S.3 Hiệu quả bảo vệ của tế bào vi khuẩn bất hoạt (FKC) đối với bệnh do Streptococcus iniae gây ra ở cá chẽm 76 3.3 SỰ HÌNH THÀNH VÀ PHÁT TRIỂN CỦA TUYẾN ỨC 80 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 85 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Tiếng Việt BA Blood Agar Môi trường thạch máu CFU Colony Forming Unit Đơn vị khuẩn lạc FKC Formalin-Killed Cells Tế bào vi khuẩn bất hoạt bằng formalin IP Intraperitoneal Injection Tiêm vào xoang bụng kDa Kilo Dalton Đơn vị tính khối lượng phân tử protein KF KF-Streptococcus Agar Môi trường nuôi cấy vi khuẩn L-15 Leibovitz Môi trường nuôi cấy tế bào LD50 Lethal Dose 50% Liều gây chết 50% OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate Buffered Saline Dung dịch muối sinh lý đệm Phosphate RPP Relative Percent Protection Hệ số bảo vệ tương đối SDS- Sodium Dodecyl Sulfate - Điện di trên gel polyacrylamide có PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis SDS TSA Tryptic Soy Agar Môi trường nuôi cấy vi khuẩn TSB Tryptic Soy Broth Môi trường nuôi cấy vi khuẩn xg Gravity Đơn vị tính lực ly tâm vi DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus iniae. Hiệu quả bảo vệ của các loại vaccine phòng bệnh do vi khuẩn S. 18 iniae sau bốn tuần tiêm chủng.3 Nguồn gốc và tác dụng của cytokin ở cá 29 Bảng 1.4 Sự hình thành các cơ quan và mô lympho ở một số loài cá 32 Bảng 3.1 Nguồn phân lập các chủng S.

iniae từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa 50 Bảng 3.2 Một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá 53 chẽm nuôi tại Khánh Hòa Bảng 3.3 Độ nhạy cảm của các chủng vi khuẩn S. iniae phân lập từ cá chẽm 58 nuôi tại Khánh Hòa đối với 12 loại kháng sinh phổ biến trong nuôi trồng thủy sản.4 Thời điểm phát hiện vi khuẩn S. iniae ở các cơ quan của cá chẽm 59 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Sản lượng và giá trị cá chẽm nuôi của thế giới từ năm 1959 – 2009 5 Hình 1.2 Tỉ lệ sản lượng cá chẽm nuôi của các nước với tổng sản lượng cá 6 chẽm nuôi trên thế giới từ năm 1959-2009 Hình 1.3 Một số bệnh thường gặp ở cá chẽm nuôi 10 Hình 2.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 35 Hình 2.2 Phương pháp xác định kháng thể kháng S. iniae trong huyết thanh 45 cá chẽm Hình 3.1 Cá chẽm mắc nhiễm Streptococcus iniae nuôi tại Khánh Hòa 51 Hình 3.

Hình dạng khuẩn lạc và tế bào các chủng vi khuẩn S. iniae phân 52 lập từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa.3 Tỉ lệ chết tích lũy ở các nhóm cá chẽm thí nghiệm sau khi tiêm S. 55 iniae vào xoang bụng với các nồng độ khác nhau.4 Tương quan giữa nồng độ vi khuẩn S. iniae tiêm vào xoang bụng 56 và tỉ lệ chết tích lũy của các nhóm cá chẽm thí nghiệm.