Nghiên cứu đặc tính của chitinase tự nhiên và biểu hiện chitinase tái tổ hợp từ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYEN HUU QUAN NGHIEN CUU DAC TINH CUA CHITINASE TU NHIEN VA BIEU HIEN CHITINASE TAI TO HOP TU CHUNG NAM LECANICILLIUM LECANH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYEN HUU QUAN NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH CỦA CHITINASE TU NHIEN VA BIEU HIEN CHITINASE TAI TO HỢP TU CHUNG NAM LECANICILLIUM LECANIT Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIỀN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học:|PGS. Quyền Đình Thi PGS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh Thái Nguyên, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận án là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS. Quyền Đình Thi, PGS.

Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ của các cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần kết quả đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành dưới sự cho phép của các đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bat kỳ các công trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận án Nguyễn Hữu Quân ii LOI CAM ON Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.

Quyền Đình Thỉ đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị và hỗ trợ kinh phí đề tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã chỉ bảo, sửa luận án đề tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và đồng nghiệp Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, hợp tác và chia sẻ kinh nghiệm chuyên môn cho tôi trong quá trình tiến hành thực nghiệm đề tài.

Tôi xin cảm ơn sự hỗ trợ của đề tài “Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm từ nắm Lecanicillium spp. đề diệt rệp muội (Aphididae) gây hại cây trồng” thuộc chương trình Công nghệ sinh học của Bộ Nông nghiệp & Phát triển nông thôn do PGS. Quyền Dinh Thi va TS. Va Van Hanh làm chủ nhiệm, 2010-2013.

Tôi xin cảm ơn Khoa Khoa học Sự sống, Phòng Đào tạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Giáo dục Trung học cơ sở, Khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiệp, Phòng Khoa học Công nghệ và Hợp tác quốc tế, Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và các bạn đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án. Lời cảm ơn sau cùng tôi xin dành cho gia đình và những người thân, bạn bẻ đã luôn động viên giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứu sinh. Tác giả luận án Nguyễn Hữu Quân iii MUC LUC Trang 0909.

ii MUC LU Co 3. iii DANH MUC CAC CHU VIET TAT ho. ix DANE MUG BAN Grsceoncsscersacennensenmemanenmoneenmansnaars xii 067. 1 1 VAL SPB GG cscs csceva cane acntocicecscnindians asta cena G0180001.

Mục tiêu nghiên CỨU. --- «¿<2 +2 vn trưng 2 3. Nội dung nghiên CỨU. Những đóng góp mới của luận án 3 5.Y nghia khoa hoc va thue tiễn của đề tài luận án.

TỎNG QUAN TÀI LIỆU. NẤm Lecanicillium Ïecdnii. 55c 55eccerreseseeeereeeeeer 4 1/2, CHIIHSG ;z2ö206120650500500845010AGESG501SSEIGI30619050BSSSSGWRRSGNSESERS8 5 1. Nguồn gốc của chitinase.

Cầu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase. Cơ chế phản ứng của chỉtinase. Các yếu tô ảnh hưởng tới hoạt tính của chỉtinase. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase.

Ung dung cita nam L. lecanii và chitinase. Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trường. Trong lĩnh vực y HỌC.

Trong linh vuc céng nghé sinh HOC. Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chỉtinase. Trên thế giới. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.

Vật liệu và hóa chất. Chủng giống cốc cốc cốc cố 31 "nh. 31 2;1:4; Dung dich'va ỞỆNsscis sen s25 s10 0203018 1465189103485131461 807803 32 2. Môi trường nuôi cấy.

Phương pháp nghiên CỨU. Phương pháp nuôi cây. Phương pháp,hóa-SỈTH:. Tinh sạch chifinase.

Nghiên cứu ánh hưởng của một số yếu tố lý hóa lên hoạt tính và độ bền của chitinase tự nhiên và tái tổ hợp. Các phương pháp sinh học phân tử.6, Phuong phap thitnghiémss: sven ssiseesaerenisesmnuranavaceevenst 46 QT. XUWAY $6 HOU eccescccesssseesseecsseesssecsssessssssssesseesssresseessssecssesssseeseessnvecseen 48 Chương 3. KÉT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.

Sàng lọc, kiểm tra và kháo sát điều kiện sinh tổng hop chitinase từ nấm E.c5cccn: 22t th tre 49 3. Sàng lọc chủng nắm L. /ecanii sinh tổng hợp chitinase cao. Kiểm tra chủng nắm L.

/ecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA. Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase. Tỉnh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của chỉitinase từ chủng năm]; :E6ecanil:ÄÃÏiissossssgtietogtngitioiged01800181GU56150100:308030:88000083008088 57 3. Tinh sạch chifinasSe.

Danh gid tinh chất lý hóa của chitinase tir ching nam L. /eeanii ST ác cóctrpoennhnnH g1 nhá gan gi 0H60 1613131636)355E2338181301314618815530180513543511578E0 018 59 3. Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chúng nấm L. Biểu hiện, tỉnh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rChit trong nắm men P.

Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nam men. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nắm men ?. Tinh sach rChit 76 3. Đánh giá tính chất lý hóa của rChit từ nắm men P.

Thứ nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh cúa chifinase và bào tử từ nẤm L. Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây trồng \68S1041955EYH1Đ68031730013014555813801 0 RPRSWGIGRESEEGIRSSXSIEVESEIGERSRSXEPASSESESSSiG08032804g0/78 84 vi 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nây mầm của bao tir nam.

Khả năng diệt rép của chủng nấm /.- 89 KET LUAN VA KIEN NGHI Lu. 92 CÁC CÔNG TRINH DA CONG BO LIEN QUAN DEN LUẬN ÁN. 94 DANH MỤC PHỤ LỤC.1mLee 113 vii DANH MUC CAC CHU VIET TAT Tiéng Anh Tiếng Việt BLAST bp cDNA Chit CMC DEPC DNA DNase dNTPs DC IPTG EDTA EtBr kb kDa OD PCR Basic local alignment search tool Base pair Complement DNA Gene encoding chitinase Cacboxyl methyl cellulose Diethylpyrocarbonate Deoxyribonucleic acid Deoxyribonuclease 2'-Deoxynucleoside 5’- triphosphate Control Isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside Ethylenediamine tetraacetic acid Ethidium bromide Kilo base Kilo Dalton Marker Optical density Polymerase chain reaction Ribonucleic acid Phần mềm so sánh trình tự Cặp bazơ DNA tao ra tr mRNA Gen ma hda chitinase Cacboxyl methyl cellulose Diethylpyrocarbonate Axit deoxyribonucleic Enzyme thủy phân DNA Cac nucleotide Đối chứng Isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside Axit ethylenediamine tetraacetic Ethidium bromide Kilo base Kilo Dalton Thang chuan Mật độ quang Phản ứng khuếch đại gen Axit ribonucleic RNase RT-PCR rChit SDS- PAGE Taq TBE TE TEMED viv wiv Vili Ribonuclease Reverse transcription polymerase chain reaction Recombinante chitinase Sodium dodecyl sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis Thermus aquaticus Tris boric acid EDTA Tris EDTA N.N- Tetramethylethylenediamine Volume/volume Weight/volume Enzyme thiy phan RNA Phan ứng khuéch dai gen Chitinase tai t6 hợp Dién di protein Thermus aquaticus Tris boric acid EDTA Tris EDTA N.N- Tetramethylethylenediamine Thể tích/thê tích Khối lượng/thê tích 1X DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nắm C.

Cấu trúc của chỉitinase từ vi khuẩn Rais/ozia sp. Cơ chế xúc tac cua chitinase B tir vi khuan S. Cơ chế thủy phân -chitin boi chitinase A tir vi khuẩn 4. Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo phương pháp Miller.

Các bước tĩnh sạch chitinase. -- --- 5 5<¿ 52 2z +2 s<£szx+zc<> Hình 2. Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo 7710 ii Hình 2. Đô thị Lineawever-Burk Hình 2.

Sơ đồ mô tả vị trí gắn của gen C?i/ vào genome của nắm men PD DOS OTIS XÃ ` tusaannhiuitdiostillllioaoa§ieskeyxsk3sgixeosl4tiei)888503886)80810461462180084860Ag08đ Hình 3. Hoạt tính chitinase của 8 chủng nấm 7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng nắm L. lecanii 43H; San phim Plasmid va San phim cat vector tái tổ hợp bằng Xhol va Xbal Hinh 3.

Trinh ty doan gen 28S rRNA tir ching nam L. lecanii 43H; Cây phân loại trinh ty gen 28S rRNA tir ching nam L. lecanii 43H véi các lgài khÁGö:sresesssnaiiititBSiNEOTOIEGSIIISANGSEDSEDILIIDETRSINSGSIREIASSEMESSSTRLIESR Hình 3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy và nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitinase .---- 2-22 +¿©x+2E22+EE+EEcEEESEEzrxerkrrxee Hình 3.

Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù và nguồn nitơ đến 13 36 38 39 40 46 49 50 51 52 khả năng sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và pH nuôi cấy lên khả năng sinh tông hợp chitinase .-¿-- 2c 52+ eSE+£2E£EEE£EEEEEEeEEEEEEEEerkrrrkerveee Hình 3. Hình ảnh điện di SDS-PAGE của chitinase tính sạch từ chủng nắm L. /eeanii 43H và hoạt tính chitinase của các phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex A-50 trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất chitin huyền phù Hình 3.

Nhiệt độ và pH thích hợp của chitinase. Độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tây rửa lên hoạt tính Chitinase sseccssinccsasrewncssn renee encom memes Hình 3. Phân tích TLC các sản phẩm thủy phân chitin bởi chỉtinase.

Kết quả nhân dòng gen C7 từ DNA hệ gen. Trinh tu gen Chit và amino acid suy diễn tir L. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tu gen Chit cua chủng L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank.

Kết quả nhân dòng gen C7 từ mRÌNA. Cây phân loại dựa vào so sánh trinh tu amino acid cua rChit từ L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank. Kết quả thiết kế cầu trúc vector biểu hiện pPChit.

Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hién rChit trong P. Khả năng sinh tổng hợp rChit của chủng tái tổ hợp khi được cảm ứng ở các nông độ methanol khác nhau. Khả năng sinh tổng hợp rChit ở các khoảng thời gian khác 35 58 60 61 64 66 66 67 68 69 70 70 71 73 XI Hinh 3. Dién di SDS-PAGE cia rChit tinh sach tir P.

Nhiệt độ và pH thích hợp của rChIt. Độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit. Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tây rửa lên hoạt tính Hinh 3. Uc ché sw phat trién cua nam bénh F.

Soi nam cua R. oxysporum được xử lý với nước va voi chitinase tir ching nam L. Hỗn hợp chitin của rệp được xử lý với nước và rChit từ nắm TIET 1005 0F XỔ: thao tsnniaigiiiirioidiiltiStiE050001A16E0A5G038880000118380889413046881 Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nay mầm của bào tử nấm 7.

Mô hình lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm và biểu đồ thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nắm 7. /ecanii 83 86 86 87 89 xI DANH MỤC BÁNG Bảng 2. Các môi trường thí nghiệm.-¿- ¿5c + sex sex ssezeessss 32 Bảng 2. Các điều kiện nuôi cấy chủng nắm ¿.

/ecani 43H sinh tổng U00. Thành phần gel cô và gel tách 38 Bảng 2. Quan hệ giữa 1/[S] và 1/V. Các cặp mỗi sử dụng.

Thành phần PCR.2--222¿©22Z+222+E+22EE22EEEEerrEEEerrrrree 44 Bảng 3.