Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen gmdreb2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐÀO XUÂN TÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmDREB2 NHẰM CẢI THIỆN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐÀO XUÂN TÂN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmDREB2 NHẰM CẢI THIỆN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Chu Hoàng Mậu 2. Lê Văn Sơn THÁI NGUYÊN - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS. Chu Hoàng Mậu (Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên) và PGS.

Các kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí Khoa học và Công nghệ trong, ngoài nước, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tất cả các nội dung trích dẫn trong luận án đều ghi rõ nguồn gốc. Thái Nguyên, tháng 02 năm 2017 TÁC GIẢ Đào Xuân Tân ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS. Chu Hoàng Mậu, PGS.

Lê Văn Sơn đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục Sinh học thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ của Phòng Công nghệ ADN ứng dụng và Phòng Công nghệ Tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận án. Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ của Khoa Sinh học và cán bộ Phòng Đào tạo thuộc Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này.

Tôi xin cảm ơn lãnh đạo Sở Giáo dục và Đào tạo Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khoá học và công tác. Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, đồng chí, đồng nghiệp, bạn bè luôn quan tâm, động viên tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Thái Nguyên, tháng 02 năm 2017 TÁC GIẢ Đào Xuân Tân iii MỤC LỤC Trang Lời cam đoan. ii Mục lục.

iii Danh mục những chữ viết tắt trong luận án. iv Danh mục bảng trong luận án. v Danh mục hình trong luận án. vi MỞ ĐẦU.

Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT. Cơ chế chịu hạn của thực vật. Họ nhân tố phiên mã AP2.

Cơ chế tác động của một số nhân tố phiên mã đối với các phản ứng stress 14 phi sinh học ở thực vật. NHÂN TỐ PHIÊN MÃ VÀ TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỊU HẠN 21 CỦA THỰC VẬT. Nâng cao khả năng chống chịu các stress bằng kỹ thuật biểu hiện mạnh 21 nhân tố phiên mã DREB ở thực vật. Hiệu quả đa hiệu trong cây chuyển gen.

Nghiên cứu điều khiển hoạt động của nhân tố phiên mã trong cải tiến 26 giống cây trồng. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG CẢI THIỆN KHẢ 28 NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG. Cây đậu tương và tác động của hạn đối với cây đậu tương. Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương.

Tiềm năng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong tạo giống đậu tương 34 chịu hạn. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU. Vật liệu thực vật.

Các chủng vi khuẩn và các loại vector. Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu. HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu.

Địa điểm nghiên cứu và hoàn thiện luận án. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen GmDREB2. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen GmDREB2.

Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A. Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen. Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG. Tách dòng, xác định trình tự gen GmDREB2 từ một số giống đậu tương. Sự đa dạng của gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tương. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT MANG GEN 70 GmDREB2.

Đặc điểm của vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen GmDREB2. Tạo vi khuẩn A. tumefacien tái tổ hợp. CHUYỂN GEN VÀ PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN GmDREB2 76 TRÊN CÂY THUỐC LÁ.

Kết quả chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2 vào cây thuốc lá thông 76 qua A. Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp GmDREB2 trên cây thuốc lá 79 chuyển gen ở thế hệ T0. Hàm lượng prolin trong các cây thuốc lá chuyển gen. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN GmDREB2 VÀ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG 82 CHUYỂN GEN TỪ GIỐNG DT84.

Tái sinh in vitro và chuyển cấu trúc chứa gen chuyển GmDREB2 vào 83 giống đậu tương DT84 qua A. Xác định sự có mặt của gen chuyển GmDREB2 trong hệ gen của các cây 86 đậu tương được chuyển gen ở thế hệ T0. Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp GmDREB2 trên cây đậu 89 tương chuyển gen. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Về kết quả phân lập gen GmDREB2. Về kết quả phân tích biểu hiện chức năng của gen GmDREB2. Về kết quả chuyển gen và phân tích cây đậu tương chuyển gen. 98 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.

101 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 104 iv vi DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN ABA Abscisic acid Axit Abxixic ABF ABRE-binding factor Nhân tố ràng buộc ABA ABRE ABA-responsive element Yếu tố cảm ứng ABA Tên một phân họ trong họ AP2 APETALA 2 AP2/ERF ABA-responsive element binding Tên một loại protein ràng buộc AREB protein với yếu tố cảm ứng ABA bp base pairs Cặp bazơ nitơ CBF CRT binding factor Nhân tố ràng buộc với CRT CCM Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy CE Coupling element Yếu tố khớp nối cs Cộng sự CRT C-repeat responsive element Yếu tố đáp ứng C-repeat Ct Threshold cycle Ngưỡng chu kỳ Yếu tố có liên quan tới sự mất DRE Dehydration responsive element nước Dehydration responsive element Một phân họ protein có liên DREB binding protein quan tới sự mất nước DREB Dehydration responsive element Nhân tố có liên quan tới sự mất factor binding - factor nước Dehydration responsive element Protein DREB2 - Một loại DREB2 binding protein 2 protein trong phân họ DREB Một loại protein tương tác với DRIP DREB2A-interacting protein DREB2A Enzyme-Linked ImmunoSorbent ELISA Xét nghiệm ELISA Assay EST Expressed Sequence Tag Trình tự đánh dấu biểu hiện Ethylene-responsive element binding ERF Nhân tố ràng buộc Ethylene factor GFP Green Fluorescene Protein Protein huỳnh quang xanh ivvii GM Germination Medium Môi trường nảy mầm Glycine max Dehydration Gen DREB2 - Gen thuộc phân GmDREB2 Responsive Element Binding gene họ DREB ở cây đậu tương Gen mã hóa enzyme GUS β-Glucuronidase gene β-Glucuronidace Môi trường dinh dưỡng cơ bản LB Luria Bertami nuôi cấy vi khuẩn Tên một loại môi trường dinh MS Murashige và Skoog, 1962 dưỡng cơ bản nuôi cấy mô OD Optical Density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Locus quy định tính trạng số QTL Quantitative trait locus lượng Một phân họ trong họ AP2/ERF RAV Related to ABI3/VP1 liên quan đến ABI3/VP1 RM Rooting Medium Môi trường tạo rễ rpm Revolution Per Minute Số vòng/phút Reverse Transcription Polymerase Phản ứng chuỗi trùng hợp - RT-PCR Chain Reaction phiên mã ngược SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi Đoạn DNA được chuyển vào T-DNA Transfer DNA thực vật TF Transcription factor Nhân tố phiên mã Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u WT Wild Type Kiểu dại v viii DANH MỤC BẢNG TRONG LUẬN ÁN Trang Bảng 1. Các gen mã hóa nhân tố phiên mã được sử dụng trong kỹ thuật 23 chuyển gen nhằm tăng cường khả năng chịu hạn của thực vật.

Thống kê một số giống đậu tương sử dụng làm vật liệu nghiên cứu. Trình tự nucleotide của các cặp mồi PCR. Thành phần phản ứng PCR với Master Mix. Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB2 vào vector tách dòng.

Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI, NcoI. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII. Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá.

Môi trường tái sinh cây đối với giống đậu tương DT84. Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen GmDREB2 giữa 62 các giống đậu tương. Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn từ gen 64 GmDREB2 giữa các giống đậu tương. Các vị trí amino acid sai khác ở miền AP2 của protein DREB2 giữa 65 các giống đậu tương nghiên cứu.

Các trình tự gen GmDREB2 phân lập từ các giống đậu tương Việt 67 Nam và các trình tự gen mang mã số trên Ngân hàng Gen được sử dụng phân tích. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của các giống đậu tương dựa 68 trên trình tự nucleotide của gen GmDREB2. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của các giống đậu tương dựa 69 trên trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2. Kết quả biến nạp cấu trúc pBI121/35S-GmDREB2-cmyc vào cây 77 thuốc lá.

Hàm lượng prolin của các cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng sau 81 5 ngày, 9 ngày stress hạn ( = 0,001). Kết quả chuyển cấu trúc chứa gen GmDREB2 vào giống đậu tương 85 DT84. Hiệu suất chuyển gen GmDREB2 vào giống đậu tương DT84 ở 88 thế hệ T0 ở các giai đoạn phân tích. vi x DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN ÁN Trang Hình 1.

Cơ chế chịu hạn của thực vật. Cây phát sinh của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF ở thực vật có 10 diệp lục. Điều hòa phiên mã và sau phiên mã của DREB2A trong cây 20 Arabidopsis. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát.

Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen pBI121-GmDREB2.