Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen rpob katg của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở việt

DAT VAN DE Lao là một trong những bệnh truyền nhiễm hàng đầu gây tỷ lệ tử vong trên thế giới ngày nay. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 1⁄3 dân số thế giới nhiễm lao. Mỗi năm, có thêm gần 9 triệu người mắc lao mới và khoảng 1,3 triệu người tử vong do lao. Trong đó, 81% số bệnh nhân thuộc về 22 nước có gánh nặng bệnh lao [133].

Trong khi đó, tỷ lệ phát hiện mặc dù liên tục được cải thiện nhưng chi dat 66 % số bệnh nhân ước tính [133], do có những hạn chế về công tác chân đoán, đặc biệt là lao kháng thuốc. Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được phát hiện và chữa trị đang tiếp tục lây lan cho cộng đồng. Theo thống kê của WHO, Việt Nam là một quốc gia có tỷ lệ bệnh lao cao. Theo báo cáo của Chương trình Chống lao Quốc gia (CTCLQG) năm 2013, tổng số người mắc lao là 190.000; trong đó, số người mắc lao mới khoảng 130.000, số trường hợp tử vong do lao ước tính là 17.

Tình hình kháng thuốc của vi khuẩn lao tại Việt Nam đang là một van dé dang lo ngai. Ty 1é vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở bệnh nhân điều tri lại là 23%, ở bệnh nhân lao mới là 4% [4]. Trong các loại kháng thuốc của vi khuẩn lao, kháng rifampicin va isoniazid - những thuốc chủ lực trong điều trị lao - được quan tâm nhất vì thường dẫn đến thất bại trong điều trị và tử vong. Theo định nghĩa của WHO, “lao kháng đa thuốc” là trường hợp kháng với ít nhất đồng thời rifampicin và isoniazid [135].

Sự đề kháng với 2 thuốc chống lao dòng 1 này được cho là có đột biến trên một số gen liên quan, đặc biét la cac gen rpoB va katG. Cac nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn lao cho thấy, rất hiếm các chủng kháng rifampicin đơn thuần mà thường có ít nhất 90% các chủng lao lâm sàng kháng rifampicin đồng thời cũng kháng isoniazid [15], [62]. Như vậy, việc phát hiện các chủng lao kháng rifampicin cũng có nghĩa là xác định được lao kháng đa thuốc [92]. Các nghiên cứu về phân tử của vi khuẩn lao kháng rifampicin đã công bố cho thấy, tính kháng rifampicin liên quan đến đột biến o gen rpoB, con khang isoniazid thường liên quan dén dot bién 6 gen katG [112], [140].

Chân đoán lao kháng thuốc chủ yếu vẫn dựa vào phương pháp kháng sinh đồ và phải mất khoảng 8 tuần mới cho kết quả. Chẩn đoán nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc, đặc biệt là kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử là cần thiết trong công tác giám sát và kiểm soát lao. Các kit thương mại của nước ngoài chân đoán lao kháng thuốc có giá thành cao và thường chỉ nhằm vào các điểm đột biến 526, 531 trên gen zpo# và 315 trên gen katG. Cac nghiên cứu về lao kháng thuốc ở từng khu vực lại phát hiện thêm các điểm đột biến ở vị trí khác như 514, 533, 176 trên gen rzpoB; đặc biệt tần số các đột biến thay đổi giữa các cộng đồng người và vùng địa lý [15], [52], [65], [88], [110], [140].

Đặc điểm phân tử của các chủng kháng thuốc phân lập được từ các vùng khác nhau trên thế giới, nhất là từ các quốc gia có tỷ lệ bệnh lao và tỷ lệ lao kháng thuốc cao sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc phát triển có hiệu quả hơn các phương pháp phân tử để phát hiện nhanh chóng tính kháng thuốc phù hợp với từng nước và từng khu vực. Việt Nam chưa có các đữ kiện đầy đủ về đặc điểm phân tử của vi khuẩn lao kháng đa thuốc trong nước nên chưa có cơ sở để áp dụng nguyên bản kit chân đoán lao kháng thuốc của nước ngoài. Vì vậy chúng tôi thực hiện dé tai: “Nghiên cứu đặc điểm phân tử gen rpoB, katG của vi khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam” nhằm mục tiêu: 1. Xác định đặc điểm phân tứ gen rpoB và katG liên quan đến kháng đa thuốc của các chủng vỉ khuẩn lao phân lập được năm 2008-2009.

Xác định giá trị của phương pháp sinh học phân tử trong chấn đoán vỉ khuẩn lao kháng đa thuốc ở Việt Nam. Chương 1 TONG QUAN 1. Bénh lao Lao là căn bệnh truyền nhiễm xuất hiện từ lâu. Các nghiên cứu dấu tích hoá thạch cho thấy, bệnh lao xuất hiện ở người khoảng 400 - 230 năm trước Công nguyên.

Đại dịch lao bùng phát ở châu Âu ở thé ky XVII, lan sang châu Mỹ và kéo dài cho đến tận thế kỷ XIX. Trong giai đoạn này, những mô tả về giải phẫu, bệnh lý, tính chất lây lan của căn bệnh nảy đã được công bố nhờ những công trình nghiên cứu của Benjamin Martien (1720), Franciscus Sylvius de la Boe (1769) va Jean-Antoine Villemin (1865). Tac nhan gay bénh lao, Mycobacterium tuberculosis, chinh thức được xác định và mô tả vào năm 1882. Đây là công trình nghiên cứu của Robert Koch (1843-1910).

Để ghi nhận công lao của ông, người ta còn gọi trực khuẩn lao gây bệnh trên người là trực khuan Koch (Bacille de Koch) [92]. Trong thé ky 20, bénh lao da giét chét khoảng 100 triệu người. Từ năm 1943, streptomycin, thuốc chồng lao đầu tiên được phát hiện và được sử dụng điều trị có hiệu quả. Sau đó hàng loạt thuốc chống lao khác ra đời đã mở ra một kỷ nguyên mới trong điều trị bệnh lao, cũng như đã cứu chữa cho hàng triệu bệnh nhân lao khỏi căn bệnh nguy hiểm này [92].

Cùng với sự phát triển của đại dịch HIV/AIDS, dịch tễ lao toàn cầu đã bước sang một hướng phát triển mới gây ra những thách thức vô cùng to lớn cho cuộc chiến chống lao của loài người, đó là sự tương tác giữa lao và đại dịch HIV/AIDS và sự phát triển của các chủng lao kháng thuốc [92], [131], [133]. Tình hình bệnh lao trên thế giới Hiện nay, trên thế giới có khoảng 2,2 tỷ người nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới). Theo số liệu công bố của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) [133], ước tính năm 2012 có thêm khoảng 8,6 triệu người mắc lao mới (trung bình 122 trường hợp trên 100 000 dân) và 1,3 triệu người tử vong do lao (trong đó, 940 000 người HIV (-) và 330 000 người tử vong do lao/HIV (+)). Trong số các trường hợp tử vong, có 170 000 trường hợp mắc lao kháng đa thuốc [133].

Phân bồ toàn cầu bệnh lao nghiêng về phía các nước có thu nhập thấp và nhóm nền kinh tế mới nổi. Hầu hết các trường hợp xảy ra ở châu Á (58%) và châu Phi (27%), một tỷ lệ nhỏ hơn ở phía đông khu vực Địa trung Hải (8%), khu vực châu Âu (4%). Khoảng §1% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao [133]. Trong tổng số 8,6 triệu người mắc lao mới trên toàn cầu năm 2012, có khoảng 13% sống chung với HIV.

Tỷ lệ các trường hợp bệnh lao đồng nhiễm với HIV cao nhất trong các quốc gia thuộc khu vực châu Phi (82%) [133]. Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Theo báo cáo của WHO năm 2012, Việt Nam đứng thứ 12/22 nước có gánh nặng bệnh lao cao trên toàn cầu. Ở khu vực Tây - Thái Bình Dương, Việt nam đứng thứ ba sau Trung quốc và Philippin về số lượng bệnh nhân lao cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm [133]. Năm 2013, tỉ lệ mắc lao mới các thể là 144/100.000 dân; tí lệ hiện mắc lao các thể là 209/100.000 dân; tỉ lệ tử vong do lao 1a 19/100.

Số liệu ghi nhận của chương trình chống lao quốc gia hàng năm cho thấy, tình hình bệnh lao ngày càng diễn biến phức tạp hơn, tỉ lệ phát hiện ca bệnh trên thực tế có thể thấp hơn con số ước tính trước đây. Một số lượng đáng kê các bệnh nhân lao chưa được chân đoán và điều trị là nguồn lây quan trọng trong cộng đồng. Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác chống lao không những trong những năm tới mà có thể còn trong thời gian khá đài [2]. Vi khuẩn lao Vị khuẩn lao có tên khoa học là Mycobacterium tuberculosis.

Thực chất tác nhân gây bệnh lao là một phức hợp gồm nhiều loài được gọi chung là Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC). Cac loài trong phức hợp này là tác nhân gây nên bệnh lao trên các vật chủ khác nhau. Khả năng gây bệnh của các loài là khác nhau, trong đó loài gây bệnh thường xuyên trên người là Mycobacterium tuberculosis (MTB). Dac diém hinh thé, céu trúc Vi khuẩn lao là trực khuẩn mảnh, dai 2-4 pm, rong 0,3-1,5 im, đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hình chữ N, Y, V hoặc thành đãy phân nhánh như cành cây.

Tuy nhiên, cũng tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và thời gian nuôi cay mà vi khuẩn có kích thước và hình dạng thay đổi, từ cầu trực khuẩn đến trực khuẩn đài [12], [92]. ¥ ee Vi khuẩn lao trên kính hién vi quang học —- Vi khun lao trên kính hiển vi điện tử Hinh 1. Hinh ảnh vi khuẩn lao * Nguồn: theo Palomino J.(2007)[92] Vi khuân lao khó bắt màu các thuốc nhuộm thông thường. Thường nhuộm theo phương pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao không bị cồn và acid làm mắt màu của carbonfuchsin, bắt màu đỏ [3], [12].

Mycobacterium tubereulosis có câu trúc vách tế bào phức tạp, hoàn hảo mà ít vi sinh vật có được. Nó không những đảm bảo cho sự tỒn tại của vi khuẩn mà còn làm cho vi khuẩn bền vững đối với hiện tượng thực bảo, khi xâm nhập vào cơ thể vi khuẩn lao khó bị tiêu điệt. Vách có vai trò quan trọng đối với khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Thành tế bào vi khuẩn lao có tỷ lệ lipit cao, chiếm tới hơn 60% trọng lượng khô của thành tế bào, trong đó axit mycolic là thành phần lipit chủ yếu.

Thành tế bảo cũng được đặc trưng bởi sự liên kết giữa các axit mycolic và các chất lipid phức tạp, tạo nên độc tính của vi khuẩn lao, làm tăng khả năng chống thấm nước của thành vi khuẩn giúp vi khuẩn tồn tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị huỷ diệt bởi đại thực bào và các tế bào miễn dịch. Axit mycolic là các chất béo nhánh anpha duy nhất tìm thấy trong thành tế bào của Mycobacterium va Corynebacterium. Ching chiếm 50% trọng lượng khô của vỏ tế bao Mycobacteria [92]. Đặc điển nuôi cấy Vi khuẩn lao ưa khí bắt buộc, không mọc được ở điều kiện kị khí.

Vì vậy, các trường hợp lao phổi, thường tồn thương hay gặp ở thuỳ trên của phổi. Tuy nhiên, trong điều kiện thiếu oxy như trong các nốt vôi hoá, cục xơ hoá, cục bã đậu rắn chắc vi khuẩn lao vẫn tồn tại ở trạng thái không hoạt động trong khá nhiều năm [3], [12], [92].