Nghiên cứu đặc điểm một số gen điều hòa sinh tổng hợp anthocyanin liên quan đến

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– PHẠM THỊ THANH NHÀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƢƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN –––––––––––––––––– PHẠM THỊ THANH NHÀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ GEN ĐIỀU HÒA SINH TỔNG HỢP ANTHOCYANIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA CÂY NGÔ NẾP ĐỊA PHƢƠNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS. LÊ TRẦN BÌNH THÁI NGUYÊN - 2014 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 3 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cộng tác với các tác giả khác. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc đăng trên các Tạp chí khoa học chuyên ngành, trong Kỷ yếu hội nghị Công nghệ sinh học và trên GenBank, với sự đồng ý cho phép của các đồng tác giả. Phần kết quả còn lại chƣa đƣợc ai công bố.

Phạm Thị Thanh Nhàn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 4 LỜI CẢM ƠN Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. Lê Trần Bình đã tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận án. Tôi xin đƣợc trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ, đặc biệt là PGS. Chu Hoàng Hà, TS.

Hoàng Hà và ThS. Lê Hoàng Đức thuộc Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất, hƣớng dẫn kỹ thuật thí nghiệm và góp ý chuyên môn để tôi hoàn thành đƣợc đề tài này. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các đồng tác giả. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh- Kỹ thuật nông nghiệp, Trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên, cùng các cán bộ trong khoa đã tạo điều kiện, động viên tôi trong học tập và hoàn thiện luận án, đặc biệt là sự giúp đỡ của các Thầy, Cô trong Bộ môn Di truyền- SHHĐ nhƣ GS.

Chu Hoàng Mậu, PGS. Nguyễn Thị Tâm, CN. Nguyễn Thị Hồng Chuyên (Phòng thí nghiệm Hóa Sinh), CN. Nguyễn Ích Chiến (Phòng thí nghiệm Di truyền & Công nghệ gen).

Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng, Phòng Quản lý đào tạo Sau Đại học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài này. Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo cùng các cán bộ của Viện Nghiên cứu Ngô Đan Phƣợng- Hà Nội đã tạo điều kiện cung cấp các giống ngô nếp địa phƣơng và những thông tin cơ bản về giống. Cuối cùng, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã đồng hành, chia sẻ cùng tôi, khuyến khích tôi hoàn thành luận án Tiến sĩ này. Thái Nguyên, tháng 05 năm 2014 Nghiên cứu sinh Phạm Thị Thanh Nhàn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ i MỤC LỤC Trang Mục lục.

i Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt. iv Danh mục các bảng. vii Danh mục các hình. ix MỞ ĐẦU.

Mục tiêu của đề tài. Nội dung nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Sơ lƣợc về cây ngô. Giá trị dinh dƣỡng và kinh tế của ngô. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam …….

Phản ứng của cây ngô trƣớc tác động của hạn. Mối liên quan giữa tác động của hạn và tính chống chịu stress ôxy hóa 10 1. Mối liên quan giữa hạn và stress oxy hóa. Các dạng oxy hoạt hóa.

Hệ thống bảo vệ cây trồng khỏi tác động của oxy hóa. Cơ sở sinh lý, sinh hoá và sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô. Cơ sở hình thái, sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn. Cơ sở sinh học phân tử của tính chịu hạn ở cây ngô.

Anthocyanin và vai trò chuyển hóa các dạng oxy hoạt hóa. Vai trò của anthocyanin khi thực vật bị hạn. Gen điều hoà tổng hợp anthocyanin ở cây ngô. Nhân tố phiên mã và điều hòa biểu hiện gen.

27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www. Nhân tố phiên mã tham gia quá trình tổng hợp anthocyanin. Ứng dụng real- time PCR nghiên cứu mức độ biểu hiện gen tham gia sinh tổng hợp anthocyanin. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Vật liệu nghiên cứu. Địa điểm nghiên cứu, hoá chất và thiết bị. Phƣơng pháp nghiên cứu. Nhóm phƣơng pháp hoá sinh.

Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của một số giống ngô địa phƣơng. Nhóm phƣơng pháp sinh học phân tử ………………………………. Phƣơng pháp tách RNA tổng số theo kit Trizol (Invitrogen). Phƣơng pháp RT- PCR ……………………………………….

Tạo vector tái tổ hơp …………………………………………. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến chủng E. Kiểm tra sản phẩm chọn dòng …………………………………. Xác định trình tự gen …………………………………….

Phƣơng pháp real- time PCR. Phƣơng pháp xử lý kết quả và tính toán số liệu. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………. Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phƣơng.

Khả năng chịu hạn của 10 giống ngô nếp địa phƣơng giai đoạn hạt nảy mầm. Ảnh hƣởng của hạn đến hàm lƣợng đƣờng và hoạt độ - amylase. Ảnh hƣởng của hạn đến sự biến đổi hoạt độ protease. Đánh giá khả năng chịu hạn của 10 giống ngô giai đoạn cây non 3 lá.

Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô khi bị hạn ………………………. Chỉ số chịu hạn tƣơng đối của kiểu gen 10 giống ngô trong điều kiện hạn nhân tạo. 61 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www. Phân nhóm 10 giống ngô nếp nghiên cứu theo mức độ chịu hạn.

Ảnh hƣởng của hạn nhân tạo đến lƣợng anthocyanin ở cây ngô nếp địa phƣơng. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong rễ của 10 giống ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong lá của 10 giống ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá của 10 giống ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo.

Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong thân và bẹ lá cây ngô qua các ngƣỡng xử lý bởi hạn nhân tạo so với đối chứng. Phân tích trình tự đoạn gen B, Lc ở giống NH và BS1. Đặc điểm trình tự đoạn gen B của giống NH và BS1. Đặc điểm trình tự đoạn gen Lc của giống NH và BS1.

Đặc điểm cấu trúc protein thuộc họ bHLH ở cây ngô. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen B và Lc bằng phản ứng real- time PCR. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen B giai đoạn cây con. Định lƣợng mức độ biểu hiện của gen Lc giai đoạn cây con.

97 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 103 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN LUẬN ÁN. 104 TÀI LIỆU THAM KHẢO ………………………………………………. 132 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ iv NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ABA Abscisic acid Axit abscisic ANR Anthocyanidin reductase Enzyme chuyển hóa flavan-3-ol ANS Anthocyanidin synthase Enzyme chuyển hóa tạo anthocyanidin APX Ascorbate peroxidase Enzyme chuyển hoá H2O2 thành H 2O bHLH Binding helix- loop- helix Protein họ bHLH Bp Base pair Cặp bazơ nitơ C1 Colored aleurone 1 Gen C1 cDNA Complementary DNA DNA sợi đôi đƣợc tổng hợp từ mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc CHI Chalcon isomerase Enzyme chuyển hóa chalcon CHP Cây hồi phục CHS Chalcone synthase Enzyme xúc tác tổng hợp chalcon CSCHTĐ Chỉ số chịu hạn tƣơng đối CKH Cây không héo DEPC Diethyl pyrocarbonate DFR Dihydroflavonol 4 reductase Enzyme chuyển hóa tạo leucoanthocyanidin DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic (ADN) DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân liên kết photphodieste của phân tử DNA DRE Dehydration responsive Yếu tố đáp ứng với hydrat hóa element Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ v ĐC Đối chứng %ĐC % so với đối chứng F3‟H Flavonoid 3‟ hydroxylase Enzyme chuyển hóa naringenin F3‟5‟H Flavonoid 3‟,5‟ hydroxylase Enzyme chuyển hóa naringenin HBV Hepatitis B virus Virus viêm gan B HCV Hepatitis C virus Virus viêm gan C HP Hồi phục KLK Khối lƣợng khô KLT Khối lƣợng tƣơi KNGN Khả năng giữ nƣớc LAR Leucoanthocyanidin Enzyme xúc tác tổng hợp flavan-3- reductase ols LEA Late embryo abundant protein trong giai đoạn muộn của quá trình hình thành phôi Lc (LC) Leaf colour Gen Lc mRNA Messenger RNA ARN thông tin MGPT chaperon Môi giới phân tử MW Molecular weight Khối lƣợng phân tử NADP Nicotinamide adenine Coenzym đƣợc sử dụng trong phản dinucleotide phosphate ứng đồng hóa NADPH Nicotinamide adenine Chất đƣợc tạ dinucleotide phosphate-oxidase PAL Phenylalanine ammonialyase Enzyme chuyển hóa L-phenylalanine Pl Purple Gen Pl Pr1 Red aleurone 1 Protein chuyên trách tổng hợp pelargonidin tạo Aleurone màu đỏ PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ vi RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic (ARN) RT- PCR Reverse transcription- Phản ứng khuếch đại cDNA từ polymerase chain reaction mRNA nhờ enzyme phiên mã ngƣợc ROS Reactive oxygen species Các dạng oxy hoạt hóa SOD Superoxide dismutase Enzyme xúc tác phản ứng loại bỏ superoxide SNP Single nucleotide Đa hình nucleotit đơn polymorphism TFs Transcription factors Các nhân tố phiên mã, hay yếu tố phiên mã 3GT Flavonoid 3‟ Enzyme xúc tác phản ứng tạo glucosyltransferase flavonol 3-O-beta-D-glucoside UFGT flavonoid 3-O- Enzyme xúc tác phản ứng O- glucosyltransferase glycosyl hóa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.vn/ vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.

Diện tích, năng suất, sản lƣợng ngô, lúa mì, lúa nƣớc thế giới 1961-2010/11. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1961 đến 2012/13. Các nhóm nhân tố phiên mã. Các giống ngô nếp địa phƣơng sử dụng trong nghiên cứu.

Thành phần phản ứng PCR. Thành phần dung dịch tách plasmid. Thành phần phản ứng real- time RT- PCR. Tỷ lệ thiệt hại của 10 giống ngô nếp bị xử lý bởi hạn nhân tạo.

Tổng hợp đánh giá khả năng chịu hạn giai đoạn cây non 3 lá của 10 giống ngô nghiên cứu …………………………………………. Hệ số tƣơng đồng về mức phản ứng của các giống trƣớc hạn …. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong rễ của 10 giống ngô. Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong lá của 10 giống ngô.

Sự biến đổi hàm lƣợng anthocyanin trong thân mầm và bẹ lá của 10 giống ngô .