Nghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus h5n1 vào cây đậu tương phụ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYEN THU HIEN NGHIEN CUU CHUYEN GEN MA HOA PROTEIN BE MAT CUA VIRUS H5N1 VAO CAY ĐẬU TƯƠNG PHUC VU SAN XUAT VACCINE THUC VAT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYÊN THU HIÈN NGHIEN CU'U CHUYEN GEN MA HOA PROTEIN BE MAT CUA VIRUS H5N1 VAO CAY DAU TUONG PHUC VU SAN XUAT VACCINE THUC VAT Chuyén nganh: Di truyén hoc Mã số: 62 42 01 21 LUAN AN TIEN Si SINH HOC Người hướng dẫn khoa học: ` ` 1. CHU HOÀNG HÀ 2. CHU HOÀNG MẬU THÁI NGUYÊN - 2013 MO DAU 1. Đặt vấn đề Cúm là một căn bệnh nguy hiểm gây tử vong cao và hằng năm trên thế giới đã có hơn nửa tỷ người mắc bệnh.

Hiện nay, virus cúm A/H5NI- chủng virus nguy hiểm nhất ở gia cầm đã lan truyền trên 40 quốc gia ở châu Á, Trung đông, châu Âu và châu Phi. Ở nước ta, dịch cúm gia cầm H5NI xảy ra từ những tháng cuối năm 2003 gây thiệt hại nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi gia cầm và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. Việt Nam và Indonesia là hai quốc gia có số người nhiễm virus cũm A/H5NI và có tỷ lệ tử vong cao nhất so với các quốc gia trên thế giới. Chính vì vậy nghiên cứu làm sáng tỏ bệnh cúm A/H5NI và nhân tố gây bệnh để xây dựng biện pháp phòng và khống chế bệnh là yêu cầu thực tiễn đặt ra.

Dịch cúm gia cầm diễn biến ngày càng phức tạp vì hệ gen của virus cúm A luôn biến đổi. Bên cạnh đó, nguồn tàng trữ và lây lan bệnh là chim di cư và thủy cầm rất khó kiểm soát và khống chế. Hiện nay, việc phòng chống virus cúm A nói chung và H5NI nói riêng, bên cạnh các biện pháp phòng chống dịch như tiêu độc, xử lý gia cầm bị bệnh, thanh lý gia cằm nhiễm hoặc nguy cơ nhiễm thì biện pháp sử dụng vaccine vẫn là hướng thiết yếu nhất để khống chế và ngăn chặn sự lây lan dịch sang người. Hiện nay, ngoài vaccine truyền thống, vaccine thế hệ mới được tạo ra bằng các phương pháp tái tổ hợp và di truyền ngược đang được sử dụng rộng rãi.

Tuy nhiên, các loại vaccine này có nhược điểm như giá thành cao, khó bảo quản và mức độ an toàn thấp. Do vậy, các nhà khoa học trên thế giới vẫn đang tiếp tục phát triển những loại vaccine mới có tính ưu việt hơn, rẻ hơn, dễ bảo quản, an toàn và hiệu quả hơn. Vaccine ăn được từ thực vật là vaccine tác động vào thể dịch, kích thích cả hệ thống miễn dịch thể dịch và miễn dịch tế bảo. Vaccine thực vật có hoạt tính tương tự như vaccine thông thường, chỉ khác là vaccine này được thực vật sản xuất trong những phần ăn được như lá, củ, quả và hạt.

Vaccine thực vật có một số ưu điểm nổi bật so với các loại vaccine khác ở chỗ có thể ăn tươi hoặc nấu chín; đễ đàng sản xuất khôi lượng lớn bằng cách tăng diện tích trồng cây chuyền gen có khả năng sản xuất kháng nguyên; vaccine thực vật có tính ôn định, an toàn cao, dé bảo quản, dễ sử dụng và có hiệu quả kinh tế. Ở Việt Nam, đậu tương là cây có giá trị kinh tế cao, hạt đậu tương là nguồn thực phẩm chính cho vật nuôi và con người. Sự biểu hiện thành công gen gus trén cây đậu tương là cơ sở của việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen để sản xuất các chất có dược tính như vaccine trong hạt đậu tương. Với ưu điểm nổi bật như sản xuất đơn giản, giá thành thấp, hiệu quả cao trong phòng bệnh và có độ an toan, vaccine sản xuất từ thực vật được xem là hướng đi phù hợp trong chiến lược chăm sóc sức khoẻ cộng đồng ở các quốc gia đang phát triển.

Xuất phát từ lý do trên chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án là: “Wghiên cứu chuyển gen mã hóa protein bề mặt của virus H5N1 vào cây đậu tương phục vụ sản xuất vaccine thực vật”. Mục tiêu nghiên cứu Thiết kế được vector mang cấu trúc gen /A, đoạn gen HAI cua virus cúm A/H5NI. Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang cấu trúc đoạn gen HA! và biểu hiện được protein tái tổ hợp HAI ở hạt đậu tương. Nội dung nghiên cứu 3.

Thiết kế và tổng hợp gen H4 vả đoạn gen HA!, nhân dòng gen HA và đoạn gen HAI trong tế bào vi khuân E.coli va tạo vector chuyên gen mang cấu tric gen HA va doan gen HAI. Biến nạp cấu tric vector chuyén gen mang gen HA va doan gen HAI vao vi khuan A. Lay nhiém vi khuan A. tumefaciens tái tô hợp vào mô lá thuốc lá và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen mang gen HA và đoạn gen HAI; 3.

Phát triển hệ thống tái sinh đa chồi phục vụ chuyền gen ở cây đậu tương; 3. Chuyên cấu trúc vector mang gen gus biểu hiện ở hạt vào cây đậu tương. Đánh giá hiệu quả chuyên gen øus ở giống đậu tương ĐT12 và DT84; 3. Chuyển cấu trúc vector mang đoạn gen A7 vào cây đậu tương và phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển HAI ở cây đậu tương của thế hệ T0; 3.

Phân tích dòng cây đậu tương chuyền gen ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật PCR và lai Western blot dé xdc dinh sự biểu hiện của protein A7 ở hạt đậu tương. Những đóng góp mới của luận án 4. Hai cầu trúc vector mang gen HA và mang đoạn gen #47 biểu hiện trong hạt đã được thiết kế thành công và tạo được chủng vi khuân Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp mang cẫu trúc gen HA, đoạn gen /⁄A/ của virus cúm A/HSN1. Giéng dau tuong DT12 va DT84 da duoc thir nghiém chuyén gen gus.

Hiéu suất chuyển gen được kiểm tra ở giai đoạn hạt là 7,8% đối với giống ĐT12 và 4,3 % với giống DT84. Chuyên cấu trúc SLHEP-HAI vào cây đậu tương và thu được § dòng cây đậu tương ở thế hệ To mang cấu trúc vector biểu hiện đặc trưng trong hạt SLHEP-HAI. Ở thế hệ TI đã thu được dòng đậu tương HII chuyên gen mang đoạn gen HAI và biểu hiện thành công protein HAI trong hạt của dòng đậu tương HII. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Về khoa học: Đã thiết kế được vector chuyên gen mang cấu trúc gen #A và đoạn gen HA! biểu hiện ở hạt thực vật.

Biểu hiện thành công gen gus ở hạt. Đã hoàn thiện được quy trình tái sinh đa chồi ở cây đậu tương. Với việc lây nhiễm vi khuẩn A. tumefaciens tai tô hợp vào mô đậu tương đã tốn thương, tạo cây đậu tương chuyển gen và đã biểu hiện thành công protein HAI của virus HSN1 trong hạt đậu tương.

Về thực tiễn: Với kết quả protein HAI đã được biểu hiện thành công trong hạt đậu tương ở thế hệ T¡ là cơ sở của việc tiếp tục kiểm tra đáp ứng khả năng miễn dịch của gia cầm, đồng thời làm tiền đề cho việc nghiên cứu sản xuất vaccine ăn được ở thực vật. Chương 1 TỎNG QUAN TÀI LIỆU 1. BENH CUM GIA CAM VA VIRUS CUM A/H5NI 1. Bệnh cúm gia cầm và dịch bệnh cúm A/H5NI Cum gia cầm (Avian Influenza, AI) là bệnh truyền nhiễm cấp tính của gia cầm, do nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae gay ra [38].

Day là nhóm virus có biên độ rộng, được phân chia thành nhiều phân type khác nhau dựa trên kháng nguyên HA và NA có trên bề mặt capsid của hạt virus. Nhóm virus cúm A có 16 phân type HA (từ H1 đến H16) và 9 phân type NA (từ N1 đến N9) và sự tái tổ hợp giữa các phân type HA và NA sẽ tạo ra nhiều phân type khác nhau về độc tính và khả năng gây bệnh [42]. Virus cam A/HS5NI có độc lực cao và gây bệnh trên người vào những năm 1996-2008 [106]. Chủng virus cúm A/HSNI được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959.

Sau đó, cũm A/HSNI đã tái xuất hiện tại Quảng Đông (1996) và Hồng Kông (1997) với sự biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng trên người và gây chết người bệnh [142]. Năm 2003, virus H5NI gây ra dịch cúm trên gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốc gia ở châu Á, châu Âu và châu Phi, trong đó có Việt Nam. Cấu trúc virus cúm A/H5NI vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực , loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên- miễn dịch và mức độ truyền lây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với những biến chủng H5NI trước đây. Các chủng virus cũúm A/HSNI thuộc phân dòng Thanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) xuất hiện cuối năm 2005, bắt đầu lan sang một số nước vùng Trung Á, Nga rồi tràn ngập vào các nước vùng Tây Á, bao gồm cả Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc-Trung Phi, trong đó Ai Cập và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất [25].

Theo thống kê của Tô chức Y tế thế giới (WHO) đến tháng 3/2013, đã có tới 622 trường hợp mắc cúm A/H5NI, trong đó có 371 trường hợp đã tử vong, chiếm 59,65%. Trong đó quốc gia có số người mắc bệnh và số tử vong cao là các nước AI cập, Indonesia và Việt Nam. Kết quả điều tra dịch tễ học cho thấy, hầu hết những ca nhiễm cúm gia cầm HSNI trên người đều có liên quan đến tiếp xúc với gia cầm bị bệnh hoặc trung gian qua thực phẩm chế biến từ gia cầm bị bệnh hoặc qua tiếp xúc trực tiếp như giết mô, vận chuyển, mua bán gia cầm. Việt Nam được WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” do virus cúm A/H5NI có các điều kiện thuận lợi đề tiền hóa thích nghỉ lây nhiễm và trở thành virus của người.

Ở Việt Nam, đại dịch bùng phát từ năm 2003, đã tái phát qua bốn đợt dịch. Đợt thứ nhất xảy ra ở 57 tỉnh, thành phố; đợt dịch thứ tư gần đây nhất xảy ra 6 21 tinh, thành phô, đã tiêu hủy trên 50 triệu gia cầm các loại, thiệt hại lên đến hàng ngàn tỷ đồng [9]. Qua điều tra dịch tễ, các trường hợp nhiễm cúm A/H5NI trên người được ghi nhận đồng thời với thời điểm có địch cúm trên gia cầm. Mặc dù số ca nhiễm ít nhưng tỷ lệ tử vong rất cao (59%) và chỉ phí điều trị rất tốn kém, do vậy biện pháp tốt nhất là dự phòng để tránh mắc bệnh [7].

Đặc tính của virus cúm A/HSNI Virus cam A/H5N1 man cảm với nhiệt độ, với các dung môi hòa tan lipid, với các loại hóa chất sát trùng và oxy hóa, với formaldehyde và với các tia phóng xạ. Các hạt virus ton tại trong pH từ 6,5 đến 7,9.