Nghiên cứu chuyển gen cbf1 và đánh giá biểu hiện trên cây đậu tương glycine max

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -------------------------------------------- NGÔ THỊ BẢO OANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2020 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -------------------------------------------- NGÔ THỊ BẢO OANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN CBF1 VÀ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN TRÊN CÂY ĐẬU TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL) Ngành: Công nghệ sinh học Mã số ngành: 8.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. NGUYỄN TIẾN DŨNG 2. NGÔ XUÂN BÌNH Thái Nguyên, năm 2020 i LỜI CẢM ƠN Trang đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm cùng các thầy cô giáo trong Khoa đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc, gửi lời cảm ơn chân thành tới GS.

Ngô Xuân Bình và thầy giáo TS. Nguyễn Tiến Dũng, giảng viên khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và hướng dẫn em trong thời gian thực hiện luận văn. Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2020 Học viên Ngô Thị Bảo Oanh ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.

ii DANH MỤC BẢNG BIỂU. iv DANH MỤC HÌNH ẢNH. vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT. vii MỞ ĐẦU.

Lý do chọn đề tài. Mục tiêu nghiên cứu. Những đóng góp mới của đề tài. Ý nghĩa Khoa học và thực tiễn của đè tài luận án.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tương. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương. Tình hình sản xuất đậu tương trong nước và trên thế giới.

Trên thế giới. Tại Việt Nam. Đặc điểm của gen CBF1. Đặc điểm gen CBF1.

Các nghiên cứu về gene CBF1. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng .1 Đặc điểm chung của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .2 Cấu trúc và chức năng của Ti-Plasmid. Cấu trúc và chức năng T-DNA .4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 14 iii Chương 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Vật liệu nghiên cứu. Vật liệu thực vật. Vật liệu di truyền. Thiết bị thí nghiệm.

Địa điểm nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Phân tích, đánh giá cây sau chuyển gen.

Chọn lọc dòng chuyển gen bằng phun chất diệt cỏ Basta. Error! Bookmark not defined. Các chỉ tiêu đánh giá. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22, cọc chùm, Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương cọc chùm. Kết quả biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc.

Đánh giá đậu tương chuyển gen dương tính bằng sử dụng phương pháp PCR. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 4847 TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1. 1 Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây.

2 Tình hình sản xuất đậu tương tại Việt Nam những năm gần đây. 1 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A. 2 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A. 3 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A.

4 Kết quả chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A. 5 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cọc chùm thông qua vi khuẩn A. 6 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. 7 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A.

8 Kết quả chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. 9 Kết quả tạo đa chồi của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. 10 Kết quả chọn lọc mẫu biến nạp của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. 11 Kết quả chuyển cây đậu tương sau biến nạp ra bầu đất của các thí nghiệm chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A.

12 Kết quả chuyển gen CBF1 vào cây đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. 13 Kết quả tách chiết DNA tổng số của các cây chuyển gen T0. 14 Đánh giá biểu hiện gen ở cây chuyển gen T0 bằng PCR. 45 vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.

Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopyne. 13 Hình 2 Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế chuyển T-DNA. Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương. Một số hình ảnh quá trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A.

Hình ảnh cây chuyển gen tái sinh trên môi trường SEM (A) và ra. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương DT22 thông qua vi khuẩn A. Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vào giống đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi và ra rễ.

Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương cọc chùm thông qua vi khuẩn A. Kết quả biến nạp – tái sinh chồi chuyển gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A. Kết quả mẫu biến nạp kéo dài chồi và ra rễ. Cây đậu tương chuyển gen thu được sau quá trình biến nạp gen CBF1 vào giống đậu tương Cúc Hà Bắc thông qua vi khuẩn A.

Hình ảnh sàng lọc cây chuyển gen sau 3 ngày bằng Basta. Kết quả phân tích PCR cây chuyển gen T0. 46 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CCM Cocultivation medium - Môi trường đồng nuôi cấy cDNA Complementary DNA CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide LB Luria-Bertani OD600 Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600 nm bằng quang phổ kế PCR Polymerase Chain Reaction PCR Polymerase Chain Reaction RM Rooting medium - Môi trường ra rễ SEM Shoot elongation medium - Môi trường kéo dài chồi SIM Shoot induction medium - Môi trường tạo đa chồi 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài.

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae) là loại cây trồng có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao. Các giống đậu tương trồng ở Việt Nam thuộc giống phụ G. Soja, chi Glycine. Hiện nay, đậu tương trồng ở Việt Nam có hai nguồn gốc, đó là các giống địa phương và các giống nhập nội [1], [2].

Hạt đậu tương có hàm lượng protein từ 32% - 52%, chứa nhiều amino acid không thay thế (lysin, triptophan, metionin, leucin.) cần thiết cho cơ thể người và động vật. Ngoài giá trị dinh dưỡng trong hạt, đậu tương còn là cây trồng lý tưởng trong hệ thống luân canh do có khả năng cải tạo đất. Sản phẩm từ cây đậu tương được sử dụng rất đa dạng như dùng trực tiếp hạt thô hoặc chế biến thành đậu phụ, ép thành dầu đậu tương, nước tương, làm bánh kẹo, sữa đậu tương.đáp ứng nhu cầu đạm trong khẩu phần ăn hàng ngày của người cũng như gia súc. Việt Nam đứng thứ 3 thế giới, sau Trung Quốc, Thái Lan về lượng tiêu thụ sữa đậu tương với khoảng 613 triệu lít/năm và thứ 7 thế giới tính theo bình quân đầu người với 6,8 lít/người/năm.

Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, đậu tương là một trong 4 loại cây trồng chủ lực, nhưng điều bất cập là diện tích gieo trồng ngày càng giảm. Diện tích đất canh tác nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp do sự phát triển của các ngành công nghiệp và dịch vụ. Bên cạnh đó, nhu cầu về sản lượng hạt đậu tương để phục vụ cho phát triển chăn nuôi, công nghiệp chế biến ngày một tăng. Sản lượng đậu tương không đáp ứng đủ nhu cầu trong nước, do đó phải nhập khẩu từ các nước bên ngoài (Theo Tổng 2 cục Hải quan (GCO), trong 8 tháng đầu vụ Mùa 2016-2017, Việt Nam đã nhập khẩu 919 nghìn tấn đậu tương trị giá 392 triệu USD).

Thêm nữa, tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu, hạn hán kéo dài, lượng mưa không đều ở các vùng vào các thời điểm trong năm là một khó khăn lớn cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ… Ngoài những tác động trực tiếp lên quá trình canh tác, biến đổi khí hậu còn làm thu hẹp diện tích. Sử dụng giống đậu tương biến đổi gen là một tiến bộ quan trọng trong ngành sản xuất đậu tương của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Đậu tương được xem là cây trồng nhạy cảm với các biến đổi khí hậu. Dưới điều kiện bất lợi của môi trường như: hạn, mặn, lạnh…sẽ làm giảm khả năng điều hòa trao đổi chất, ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cây, làm giảm năng suất cây trồng.

Gen CBF (C-repeat binding factor) là một nhóm gen có mặt trong nhiều loại thực vật như: Arabidopsis, lúa mì, cà chua, cây cải… Có bốn thành viên của họ CBF giữ vai trò quan trọng trong cây, giúp cây phản ứng với những stresses phi sinh học, giúp các hoạt động trao đổi chất tiếp tục diễn ra không bị ngừng trệ, làm tăng thời gian sinh trưởng và phát triển của cây. Dó đó sẽ góp phần cải thiện năng suất cũng như chất lượng hạt. Ba gen CBF1, CBF2 và CBF3 nằm trên nhiễm sắc thể số 4 phản ứng với nhiệt lạnh [30] đã chứng minh vai trò nâng cao tính chịu lạnh ở cây thông qua cơ chế bảo vệ tế bào khi gặp điều kiện bất lợi [31] trong khi gen CBF4 rất cần thiết cho phản ứng khi khô hạn xảy ra. Ngoài vai trò tăng cường khả năng chịu lạnh của thực vật gen CBF2 ở Arabidopsis đã được chứng minh làm chậm quá trình lão hóa của lá và kéo dài tuổi thọ khoảng thời gian hai tuần [28].