Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học in vitro của một số aporphine alkaloid

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÙI THẾ VINH Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học in vitro của một số aporphine alkaloid từ cây Tơ xanh (Cassytha filiformis L.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học in vitro của một số aporphine alkaloid từ cây Tơ xanh (Cassytha filiformis L.) Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62423015 Phản biện 1: PGS. Đỗ Thị Hồng Tƣơi Phản biện 2: TS. Bùi Thị Kim Lý Phản biện 3: TS. Đinh Minh Hiệp Phản biện Ďộc lập 1: PGS.

Đỗ Thị Hồng Tƣơi Phản biện Ďộc lập 2: TS. Nguyễn Hoàng Dũng LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TRẦN CÔNG LUẬN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2019 LỜI CÁM ƠN Tôi xin gửi lời tri ân Ďến Thầy PGS. Trần Công Luận Ďã tận tình chỉ dạy, truyền Ďạt kiến thức, tận tình hƣớng dẫn, Ďộng viên, luôn tạo Ďiều kiện tốt nhất cho tôi có thể hoàn thành khóa học nghiên cứu sinh cũng nhƣ luận án này.

Xin gửi lời cảm ơn Ďến quý Thầy Cô giảng dạy khóa NCS 2011, quý Thầy Cô trong bộ môn Sinh hóa – Đại học Khoa học tự nhiên cùng với phòng Đào tạo sau Ďại học Ďã giúp Ďỡ, tạo mọi Ďiều kiện cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận án NCS của mình. Chân thành cám ơn quý Thầy, Cô, các anh chị, bạn Ďồng nghiệp tại Trung tâm Sâm và Dƣợc liệu Tp. Hồ Chí Minh, cùng các bạn sinh viên thực tập Ďã hỗ trợ, giúp Ďỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án NCS. Xin cám ơn các anh, chị cùng khóa NCS năm 2011 Ďã quan tâm, chia sẻ cùng tôi trong những năm học tập và thực hiện khóa luận.

Đặc biệt, xin gửi lời cám ơn Ďến gia Ďình, ngƣời thân Ďã quan tâm, Ďộng viên, tạo Ďiều kiện tốt nhất Ďể tôi có thể hoàn thành luận án này. Hồ Chí Minh, ngày 20/05/2019 Tác giả luận án Bùi Thế Vinh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam Ďoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của Thầy hƣớng dẫn. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là trung thực và chƣa Ďƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án i MỤC LỤC TRANG LỜI CAM ĐOAN.

ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. iv DANH MỤC CÁC BẢNG. viii DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

Đặc Ďiểm sinh học và thành phần hoá học của cây Tơ xanh. Những nghiên cứu trong và ngoài nƣớc liên quan Ďến Ďề tài. Hợp chất alkaloid và alkaloid có cấu trúc khung aporphin. Hợp chất alkaloid.

Alkaloid có khung aporphin. Dƣợc tính của aporphin. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị.

Hóa chất và trang thiết bị. Phƣơng pháp nghiên cứu về thực vật học. Thu mẫu và xử lý mẫu. Khảo sát Ďặc Ďiểm hình thái.

Khảo sát Ďặc Ďiểm vi học. Phƣơng pháp nghiên cứu về hóa học. Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật. Khảo sát chọn lựa phƣơng pháp thu nhận alkaloid toàn phần.

Chiết xuất alkaloid. Tinh chế và phân lập alkaloid. Xác Ďịnh các Ďặc tính lý hóa của alkaloid tách Ďƣợc. Phƣơng pháp nghiên cứu hoạt tính sinh học.

Hoạt tính quét gốc tự do DPPH. Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do. Khảo sát tính Ďộc tế bào trên tế bào ung thƣ. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm bằng phƣơng pháp khuếch tán qua Ďĩa giấy.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. Kết quả nghiên cứu thực vật học. Khảo sát về Ďặc Ďiểm sinh thái. Khảo sát về Ďặc Ďiểm hình thái.

Khảo sát Ďặc Ďiểm vi học. Phƣơng pháp nghiên cứu về hóa học. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật .2 Chiết xuất alkaloid. Tinh chế và phân lập alkaloid.

Các Ďặc tính lý hóa của alkaloid Ďã phân lập. Kết quả nghiên cứu hoạt tính sinh học. Hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt tính Ďộc tế bào .2 Thử nghiệm MTT .3 Thử nghiệm WST-1 .4 Thử nghiệm western blot.

Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ. 100 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC…………………………….101 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………….102 iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ACN Acetonitrile ADP Adenosine diphosphat ALP Alkaline phosphatase Enzym hydrolase, khử nhóm phosphat. AMP Adenosine monophosphat ATP Adenosine triphosphat A549 Human bronchogenic Tế bào ung thƣ phổi không tế bào carcinoma nhỏ ở ngƣời BSA Bovine serum albumin B16-F10 Human melanoma Tế bào ung thƣ da ở ngƣời carcinoma CH2Cl2 Dicloromethan CHCl3 Cloroform CytP450 Cytochrome P450 Enzym thuộc nhóm monooxygenase DCM Dichlorometan Dd Dung dịch DPPH 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl; α,α- diphenyl-β- picrylhydrazyl DĐVN Dƣợc Ďiển Việt Nam DNA Deoxyribose nucleic acid Acid nucleic ECL Enhanced hemiluminescence Khuếch Ďại tín hiệu phát quang ED50 Effective dose 50% Liều có hiệu quả trên 50% súc vật thử nghiệm EtOH Ethanol iv EtOAc Ethyl acetat GMP Guanosine monophosphat GOT Glutamic oxaloacetic Enzym chuyển nhóm amin trên transaminase oxaloacetic của gan GPT Glutamic pyruvic Enzym chuyển nhóm amin trên transaminase pyruvic của gan HeLa Human cervical Tế bào ung thƣ cổ tử cung ở ngƣời adenocarcinoma Hep-G2 Human hepatocyte Tế bào ung thƣ gan ở ngƣời carcinoma Hep-2 Larynx carcinoma Ung thƣ thanh quản HL-60 Human promyelocytic Tế bào ung thƣ bạch cầu ngƣời leukemia HMBC Heteronuclear Multiple Phổ NMR 2 chiều Bond Correlation HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatoghraphy HSQC Heteronuclear Single- Phổ NMR 2 chiều Quantum Correlation IC50 Inhibitory concentration Nồng Ďộ ức chế 50% 50% IR Infrared radiation Bức xạ hồng ngoại LD50 Lethal dose 50% Liều gây chết 50% súc vật thử nghiệm LDL Low-density lipoprotein Lipoprotein tỷ trọng thấp M Mean Trung bình MCF-7 Human breast Tế bào ung thƣ vú ở ngƣời adenocarcinoma v Mel-5 Human melanoma Tế bào ung thƣ da ở ngƣời carcinoma MeOH Methanol MIC Minimal Inhibitory Concentration MPLC Medium Pressure Liquid Sắc ký lỏng trung áp Chromatography MS Mass Spectra Khối phổ MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide NCI National Cancer Institute Viện Ung thƣ Quốc gia NMR Nuclear Magnetic Cộng hƣởng từ hạt nhân Resonance NXB Nhà xuất bản OD Optical Density Mật Ďộ quang PBS Phosphate Buffered Saline Đệm muối phosphat PC12 Pheochromocytoma Tế bào u tủy thƣợng thận ở chuột PE Petroleum Ether Ether dầu hỏa Rf Ratio of Flow Giá trị Rf RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tƣơng Ďối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SDA Sabouraud Dextrose Agar Môi trƣờng thạch Sabouraud SKLM Sắc ký lớp mỏng THF Tetrahydrofuran TSA Tryptone casein Soy Agar Môi trƣờng rắn TSA TSB Tryptone casein Soy Broth Môi trƣờng lỏng TSB tr., pp Trang UV Ultraviolet Tử ngoại vi V0 Cassythin V1 Cassythidin V2 Thalicminin V3 Cassamedin V4 1,2;10,11-methylen dioxid – 3 methoxy -4-en aporphin V5 1,2-dimethylen dioxid – 3,10,11- trimethoxy oxoaporphin WCE Whole cell extraction WST-1 Water-soluble tetrazolium-1 5-HT 5-hydroxy tryptamine (serotonine) 687-0 Kidney carcinoma Ung thƣ thận vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.

Các nhóm chức ở một số aporphin. Tóm tắt quy trình phân tích sơ bộ hóa thực vật. Dãy nồng Ďộ của các mẫu thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH. Quy trình thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH.

Dãy nồng Ďộ của các mẫu thử hoạt tính quét hydroxyl tự do. Quy trình thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do. Đánh giá tác Ďộng kháng khuẩn, kháng nấm. Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật.

Kết quả xác Ďịnh từng hợp chất. Kết quả chiết xuất cao alkaloid tổng. Chiết xuất phân Ďoạn MeOH. Kết quả kiểm tra các phân Ďoạn của cột.

Kết quả các chất thu Ďƣợc qua sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng chế hóa. Thông số các cột sắc ký. Kết quả cột C. Kết quả cột C1.

Kết quả sắc ký cột C1. Kết quả cột C2. Bảng kết quả cột C2. Kết quả sắc ký lớp mỏng Ďiều chế.

Phổ NMR 1 chiều và 2 chiều của V0 so với Cassythin. Kết quả phổ NMR của V1. Kết quả phổ NMR của chất V2. Kết quả phổ proton của chất V3 và so sánh với V2.

Kết quả phổ NMR của chất V3. Kết quả phổ NMR của chất V4. Kết quả phổ NMR của V5. Tỉ lệ phần trăm gây Ďộc tế bào của Atp, cao tổng MeOH, V0 và V1.

Tổng hợp giá trị IC50 của các mẫu thử. Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các chất thử nghiệm. Xác Ďịnh MIC chất V4. 98 ix DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.

Cấu trúc aporphin căn bản. Cấu trúc aporphin và các dẫn xuất. Tỷ lệ các phƣơng pháp thử hoạt tính chống oxy hóa Ďƣợc sử dụng. Phƣơng trình chuyển hóa gốc DPPH.

Công thức MTT và formazan. Công thức WST-1 và formazan. Sự cảm ứng apoptosis qua PARP và Caspas. Cây Tơ xanh kí sinh trên cây tràm gió.

Hoa Ďồ và hoa Tơ xanh. Dạng hoa, quả, hạt của cây Tơ xanh. Hạt Tơ xanh cắt dọc và cắt ngang. Vi phẫu thân Tơ xanh (X10).

Chi tiết các mô ở vi phẫu thân Tơ xanh. Soi bột dƣợc liệu Tơ xanh (X40). Vi phẫu trục phát hoa Tơ xanh. Kết quả Ďịnh tính alkaloid bằng phản ứng hóa học.

SKLM Ďịnh tính alkaloid. SKLM Ďịnh tính alkaloid. SKLM so sánh Ďịnh tính alkaloid trong dịch chiết của 2 cách chiết. Kiểm tra các phân Ďoạn MeOH.

SKLM kiểm tra các phân Ďoạn. Kiểm tra phân Ďoạn cột C (1-8). Sắc ký Ďồ kiểm tra phân Ďoạn 3 cột C phát hiện bằng. Sắc ký Ďồ kiểm tra phân Ďoạn cột C1 (1-4).

Kiểm tra phân Ďoạn cột C1. Kiểm tra phân Ďoạn cột C2 (1-9). Sắc ký Ďồ kiểm tra phân Ďoạn cột C2. Kiểm tra các chất (V2-V5) sau Ďiều chế.

Tƣơng quan HMBC và COSY của V0. Cấu trúc của Cassythin. Cấu trúc của V1 (Cassythidin). Cấu trúc của V2 (Thalicminin).

Cấu trúc của V3 (Cassamedin). So sánh phổ 1H-NMR của V3 và V2 (Thalicminin). Cấu trúc của V4. Cấu trúc của V5 (1,2-dimethylen dioxid - 3,10,11- trimethoxy oxoaporphin).

Biểu Ďồ so sánh % hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của các mẫu thử. Kết quả quét gốc hydroxyl tự do của các mẫu thử. Biểu Ďồ so sánh % hoạt tính quét gốc HPPH của các mẫu thử. Kết quả quét gốc tự do DPPH của các mẫu thử.

Kết quả sàng lọc MTT của các mẫu thử. Kết quả WST-1 của các mẫu thử. Kết quả western blot xác Ďịnh sự cảm ứng apoptosis. Chuẩn bị các dịch chiết.

Chiết xuất alkaloid. Tách chiết alkaloid .1 Qui trình chiết alkaloid bằng acid loãng trong nƣớc .