Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích kháng lên sự biểu hiện của một số gen tham gi

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TRƯƠNG THỊ PHƯƠNG LAN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT KÍCH KHÁNG LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA MỘT SỐ GEN THAM GIA QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CURCUMINOID Ở TẾ BÀO NGHỆ ĐEN (Curcuma zedoaria Roscoe) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC THỰC VẬT Mã số: 9420112 Người hướng dẫn khoa học: GS. NGUYỄN HOÀNG LỘC HUẾ - NĂM 2019 LỜI CÁM ƠN Hoàn thành luận án này, trước hết chúng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn tận tình. Xin được bày tỏ lòng biết ơn tới cán bộ giảng viên của Bộ môn Sinh học Ứng dụng, Bộ môn Công nghệ Sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế; Phòng thí nghiệm Các hợp chất thứ cấp, Viện tài nguyên, Môi trường và Công nghệ sinh học, Đại học Huế (giai đoạn 2013-2014); Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã giúp đỡ chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Xin cám ơn Ban Giám đốc, Ban đào tạo Sau đại học của Đại học Huế; Ban Giám hiệu, Phòng Nghiên cứu Khoa học và hợp tác Quốc tế; Phòng Đào tạo Sau đại học -Trường đại học Khoa học; Ban chủ nhiệm Khoa sinh học-Trường Đại học Khoa học- Đại học Huế ; Ban Giám hiệu, Khoa Dược, Khoa cơ bản, Bộ môn Sinh học-Trường Đại học Y Dược Huế đã có nhiều giúp đỡ quý báu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để chúng tôi hoàn thành luận án.

Xin cám ơn các đồng nghiệp, bạn bè đã nhiệt tình động viên, hỗ trợ chúng tôi hoàn thành luận án. Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình đã luôn giúp đỡ, động viên và khích lệ cả vật chất lẫn tinh thần. Xin trân trọng cảm ơn! Huế, ngày tháng năm 2019 Tác giả Trương Thị Phương Lan i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, khách quan, nghiêm túc và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm. Tác giả luận án Trương Thị Phương Lan ii BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT BAP 6-benzylaminopurine CoA coezyme A cs cộng sự CTAB hexadecyltrimethylammonium bromide CzDCS Curcuma zedoaria DCS CzCURS1 Curcuma zedoaria CURS1 CzCURS2 Curcuma zedoaria CURS2 CzCURS3 Curcuma zedoaria CURS3 ĐC đối chứng DPPH 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl dw dry weight (khối lượng khô) FRAP ferric reducing antioxidant power fw fresh weight (khối lượng tươi) HPLC high-performance liquid chromatography IBA 3-indolebutyric acid KIN kinetin MAPK mitogen-activated protein kinase MeJA methyl jasmonate MS Murashige and Skoog (1962) NAA naphthaleneacetic acid NO nitric oxide PAA phenyl acetic acid ROS reactive oxygen species SA salicylic acid SNP sodium nitroprusside YE yeast extract (dịch chiết nấm men) iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. i BẢNG CHÚ THÍCH CHỮ VIẾT TẮT. ii MỤC LỤC.

iii DANH MỤC CÁC BẢNG. vii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH. viii MỞ ĐẦU. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU. NỘI DUNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. CÂY NGHỆ ĐEN.

Đặc điểm thực vật học. Thành phần hóa học chính của củ nghệ đen. Công dụng của nghệ đen. Hoạt tính giảm đau.

Hoạt tính kháng ung thư. Hoạt tính bảo vệ gan. Hoạt tính kháng viêm và chống loét. Hoạt tính chống oxy hóa.

Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm. Các hoạt tính khác. ELICITOR VÀ CÁC ỨNG DỤNG. Cơ chế kích kháng.

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự kích kháng. Ứng dụng của elicitor. Elicitor sinh học. Elicitor phi sinh học.

CÁC GEN THAM GIA TỔNG HỢP CURCUMINOID. Các con đường sinh tổng hợp curcuminoid. Vai trò của các gen tham gia chu trình tổng hợp curcuminoid. Gen mã hóa enzyme diketide-CoA synthase (DCS).

Gen mã hóa enzyme curcumin synthase (CURS). Gen mã hóa enzyme Curcuminoid synthase. Gen mã hóa enzyme Chalcone synthase. Tổng hợp curcuminoid theo phương thức tái tổ hợp.

Cải thiện sự biểu hiện gen bằng xử lý elicitor. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Nuôi cấy in vitro cây nghệ đen. Khử trùng mẫu vật. Tái sinh chồi và tạo rễ in vitro. Nuôi cấy callus.

Nuôi cấy tế bào. Phân lập các gen tổng hợp curcuminoid. Tách chiết DNA tổng số. Khuếch đại PCR.

Tạo dòng và chú giải gen. Xây dựng cây phả hệ. Xác định sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid. Phân tích RT-PCR.

Phân tích HPLC. Xử lý thống kê. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO.

Nhân giống cây nghệ đen in vitro. Tạo rễ in vitro. Nuôi cấy callus. Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN.

Ảnh hưởng của 2,4-D và NAA. Ảnh hưởng của 2,4-D và AgNO3. Nuôi cấy tế bào nghệ đen. NHẬN DẠNG CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID.

Phân lập gen. Phân tích biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid. ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CURCUMINOID. Thăm dò ảnh hưởng của các elicitor lên biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid.

Biểu hiện của gen tổng hợp curcuminoid. THIẾT LẬP NUÔI CẤY TẾ BÀO. Nhân giống cây nghệ đen in vitro. Nuôi cấy callus và tế bào cây nghệ đen.

PHÂN LẬP CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID. Phân lập gen tổng hợp curcuminoid. Sự biểu hiện của các gen tổng hợp curcuminoid. NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR LÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GEN TỔNG HỢP CURCUMINOID.

Đặc điểm của các elicitor sử dụng trong nghiên cứu. Dịch chiết nấm men. Ảnh hưởng của elicitor lên sự sinh trưởng của tế bào. Ảnh hưởng của elicitor lên mức độ biểu hiện gen.

Ảnh hưởng của các elicitor lên khả năng sản xuất curcumin. 92 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 95 DANH MỤC CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

97 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Phân loại các elicitor khác nhau. Một số ứng dụng elicitor để cải thiện khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy in vitro. Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng CDS của các gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen.

Trình tự các primer được dùng để khuếch đại vùng chỉ thị của các gen tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in vitro nguyên vẹn. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tái sinh chồi mới của chồi in vitro đã được chẻ đôi. Ảnh hưởng của AgNO3 lên khả năng tạo rễ của chồi in vitro.

Ảnh hưởng của KIN từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng của callus nghệ đen .5 Ảnh hưởng của NAA từ 0,5-2 mg/L và 2,4-D 1 mg/L lên sinh trưởng của callus nghệ đen. Ảnh hưởng của 2,4-D 1 mg/L và AgNO3 từ 0,5-2 mg/L lên sinh trưởng của callus nghệ đen. Mật độ băng DNA từ phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ đen. Mật độ các băng DNA của vùng đặc hiệu ở các gen tổng hợp curcuminoid.

Ảnh hưởng của các elicitor lên sinh trưởng và tích lũy curcumin trong tế bào nghệ đen. 77 viii DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 1. Cấu trúc hóa học của các curcumin. Con đường sinh tổng hợp các curcuminoid trong cây nghệ vàng.

Vai trò của các gen DCS và CURS trong tổng hợp curcuminoid ở nghệ vàng. Cây nghệ đen. Vector pGEM®-T Easy (Promega, Mỹ). Vị trí của primer xuôi và ngược trên gen CzCURS1.

Cây nghệ đen in vitro 2 tháng tuổi. Callus nghệ đen 2 tuần tuổi sinh trưởng trên môi trường có 2,4-D 1 mg/L kết hợp với KIN 1,5 mg/L (A) và đối chứng sinh trưởng trên môi trường có 2,4-D 3 mg/L kết hợp với BAP 3 mg/L (B). Đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ đen. Tế bào nghệ đen nuôi trong bình tam giác chứa môi trường MS bổ sung 2,4-D 3 mg/L và BAP 3 mg/L.

Sinh khối tươi (A) và khô (B) của tế bào nghệ đen. Sản phẩm PCR của các gen tổng hợp curcuminoid khuếch đại từ DNA tổng số của nghệ đen. Sơ đồ sắp xếp của các intron/exon trên 4 gen sinh tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzDCS (MF663785) ở nghệ đen và DCS ở nghệ vàng (AB495006.

So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS1 (MF402846) ở nghệ đen và CURS1 ở nghệ vàng (AB495007. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS2 (MF402846) ở nghệ đen và CURS2 ở nghệ vàng (AB506762. So sánh trình tự nucleotide (nu) vùng CDS của gen CzCURS3 (NCBI: MF987835) ở nghệ đen và CURS3 ở nghệ vàng (NCBI: AB506763. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzDCS và DCS (C0SVZ5.

So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS1 và CURS1 (AJF45913. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS2 và CURS2 (BAW81545. So sánh trình tự amino acid suy diễn của 2 gen CzCURS3 và CURS3 (AJF45914. Cây phả hệ của các gen sinh tổng hợp curcuminoid.

Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzDCS, CzCURS1, CzCURS2 và CzCURS3 trong 2 loại mô khác nhau của nghệ đen. Phổ HPLC của curcumin chuẩn. Phổ HPLC của dịch chiết củ nghệ đen. Phổ HPLC của dịch chiết callus nghệ đen.

RNA tổng số của các mẫu tế bào sau khi được xử lý elicitor. Phân tích RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen CzCURS1 (A) và CzCURS3 (B) sau khi được xử lý elicitor. Sản phẩm RT-PCR vùng đặc hiệu của các gen sinh tổng hợp curcuminoid ở nghệ đen. Phổ HPLC của curcumin chuẩn.

Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với YE 1 g/L sau 5 ngày nuôi cấy. Phổ HPLC của dịch chiết tế bào được xử lý với SA 100 µM sau 5 ngày nuôi cấy. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) còn được gọi là nga truật, tam nại hay ngải tím là loài thảo dược bản địa ở Ấn Độ và Indonesia, nhưng cũng được trồng nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, Brazil, Nepal, Thái Lan [78] và Việt Nam [7]. Nghệ đen từ lâu đã được sử dụng trong y học cổ truyền của nhiều nước để điều trị các chứng viêm, đau nhức, các bệnh về da như các vết thương và các vết lở loét, cũng như sự bất thường của chu kỳ kinh nguyệt [157].

Nhóm chất màu curcuminoid bao gồm curcumin và các dẫn xuất của nó như demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin là nhóm hợp chất chính tạo nên các hoạt tính sinh học quan trọng của củ nghệ [76].