Luận án tiến sĩ: Nghiên cứu đặc tính chitinase từ nấm Lecanicillium lecanii

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan bản luận án là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của PGS. Quyền Đình Thi, PGS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ của các cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các số liệu luận án là trung thực, một phần kết quả đã được công bố trên các tạp chí chuyên ngành dưới sự cho phép của các đồng tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ các công trình nào khác.

Tác giả luận án ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS. Quyền Đình Thi đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện hóa chất, thiết bị kinh phí để tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh đã chỉ bảo, sửa luận án để tôi hoàn thành luận án này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ chia sẻ kinh nghiệm chuyên môn cho tôi trong quá trình thực nghiệm. Nghiên cứu sản xuất và sử dụng chế phẩm từ nấm Lecanicillium thôn do PGS. Quyền Đình Thi và TS. Vũ Văn Hạnh làm chủ nhiệm, 2010- 2013.

Tôi xin cảm ơn Khoa Khoa học Sự sống, Phòng Đào tạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình. Tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Giáo dục T , Khoa Sinh -K , Phòng Khoa học Công nghệ và Hợp tác quốc tế, Ban Giám hiệu Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên và các bạn đồng nghiệp đã ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án. Lời cảm ơn sau cùng tôi xin dành cho gia đình và những người thân, bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình làm nghiên cứu sinh. Tác giả luận án 3 MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN.

ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT. vii DANH MỤC HÌNH. ix DANH MỤC BẢNG.

xii MỞ ĐẦU. Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Những đóng góp mới của luận án.

Nấm Lecanicillium lecanii. Nguồn gốc của chitinase. Phân loại chitinase. Cấu trúc và trung tâm hoạt động của chitinase.

Cơ chế phản ứng của chitinase. Các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính của chitinase. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase. Ứng dụng của nấm L.

lecanii và chitinase. Trong lĩnh vực nông nghiệp và bảo vệ môi trường. Trong lĩnh vực y học. Trong lĩnh vực công nghệ sinh học.

Một số nghiên cứu về gen và biểu hiện gen mã hóa chitinase. Trên thế giới. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. Vật liệu và hóa chất.

Dung dịch và đệm. Môi trường nuôi cấy. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận án. Phương pháp nghiên cứu.

Phương pháp nuôi cấy. Phương pháp nghiên cứu trên enzyme/protein…. Các phương pháp sinh học phân tử. Các phương pháp thử nghiệm.

Xử lý số liệu. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN. Sàng lọc, kiểm tra và khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase 5 từ nấm L. Sàng lọc chủng nấm L.

lecanii sinh tổng hợp chitinase cao. Kiểm tra chủng nấm L. lecanii 43H dựa vào đoạn gen 28S rRNA. Khảo sát điều kiện sinh tổng hợp chitinase.

Tinh sạch và đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L. Tinh sạch chitinase. Đánh giá đặc tính lý hóa của chitinase từ chủng nấm L. Nhân dòng gen mã hóa chitinase từ chủng nấm L.

Biểu hiện, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hóa của rChit trong nấm men P. Thiết kế plasmid pPChit biểu hiện gen Chit trong nấm men. Biểu hiện chitinase tái tổ hợp trong nấm men P. Tinh sạch rChit.

Đánh giá đặc tính lý hóa của rChit từ nấm men P. Thử nghiệm khả năng ức chế rệp và nấm bệnh của chitinase và bào tử từ nấm L. Ảnh hưởng của chitinase tới sự phát triển của nấm bệnh hại cây trồng. Ảnh hưởng của rChit tới khả năng phát triển của rệp.

Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của sợi nấm. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng nẩy mầm của bào tử nấm. Khả năng diệt rệp của chủng nấm L. 90 6 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.

94 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 95 DANH MỤC PHỤ LỤC. 114 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng Anh Tiếng Việt BLAST Basic local alignment search tool Phần mềm so sánh trình tự bp Base pair Cặp bazơ cDNA Complement DNA DNA bổ sung Chit Gene encoding chitinase Gen mã hóa chitinase CMC Cacboxyl methyl cellulose Cacboxyl methyl cellulose DEPC Diethylpyrocarbonate Diethylpyrocarbonate DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DNase Deoxyribonuclease Enzyme thủy phân DNA dNTPs 2 -Deoxynucleoside 5 - Các nucleotide triphosphate ĐC Control Đối chứng IPTG Isopropyl-beta-D- Isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside thiogalactopyranoside EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid Axit ethylenediamine tetraacetic EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide kb Kilo base Kilo base kDa Kilo Dalton Kilo Dalton M Marker Thang chuẩn OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic 8 RNase Ribonuclease Enzyme thủy phân RNA RT-PCR Reverse transcription polymerase Phản ứng khuếch đại gen chain reaction rChit Recombinante chitinase Chitinase tái tổ hợp SDS- Sodium dodecyl sulfate Điện di biến tính protein trên gel PAGE Polyacrylamide gel polyacrylamide electrophoresis Taq Thermus aquaticus Thermus aquaticus TBE Tris boric acid EDTA Tris boric acid EDTA TE Tris EDTA Tris EDTA TEMED N,N,N ,N - N,N,N ,N - Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine v/v Volume/volume Thể tích/thể tích w/v Weight/volume Khối lượng/thể tích 9 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. Cấu trúc bậc 2 của chitinase từ nấm C.

Cấu trúc của chitinase từ vi khuẩn Ralstonia sp. Cơ chế xúc tác của chitinase B từ vi khuẩn S. Cơ chế thủy phân β-chitin bởi chitinase A từ vi khuẩn B. Đường chuẩn nồng độ N-acetyl glucosamine theo phương pháp Miller.

Các bước tinh sạch chitinase. Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết thanh bò theo Bradford. Đồ thị Lineawever-Burk. Sơ đồ mô tả vị trí gắn của gen Chit vào genome của nấm men P.

Hoạt tính chitinase của 8 chủng nấm L. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ khuôn DNA của chủng nấm L. lecanii 43H; Sản phẩm Plasmid và Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XhoI và XbaI. Trình tự đoạn gen 28S rRNA và cây phân loại trình tự gen 28S rRNA từ chủng nấm L.

lecanii 43H với các loài khác……………………. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của nồng độ chitin huyền phù và nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp chitinase. Ảnh hưởng của nguồn cacbon và pH nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp chitinase.

Hình ảnh điện di SDS-PAGE của chitinase tinh sạch từ chủng nấm L. lecanii 43H và hoạt tính chitinase của các phân đoạn qua cột DEAE-Sephadex A-50 trên đĩa thạch có bổ sung cơ chất chitin huyền phù 0,5%. Nhiệt độ và pH thích hợp của chitinase. Độ bền nhiệt và độ bền pH của chitinase.

Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính chitinase. Phân tích TLC các sản phẩm thủy phân chitin bởi chitinase. Kết quả nhân dòng gen Chit từ DNA hệ gen. Trình tự gen Chit và amino acid suy diễn từ L.

Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự gen Chit của chủng L. Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank. Kết quả nhân dòng gen Chit từ mRNA. Cây phân loại dựa vào so sánh trình tự amino acid của rChit từ L.

Lecanii 43H và các chủng khác trong GenBank. Kết quả thiết kế cấu trúc vector biểu hiện pPChit. Điện di sản phẩm kiểm tra hệ biểu hiện rChit trong P. Khả năng sinh tổng hợp rChit của chủng tái tổ hợp khi được cảm ứng ở các nồng độ methanol khác nhau.

Khả năng sinh tổng hợp rChit ở các khoảng thời gian khác nhau. Điện di SDS-PAGE của rChit tinh sạch từ P. Nhiệt độ và pH thích hợp của rChit. Độ bền nhiệt và độ bền pH của rChit.

Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ và chất tẩy rửa lên hoạt tính rChit. Ức chế sự phát triển của nấm bệnh F. solani bởi chitinase. Sợi nấm của R.

oxysporum được xử lý với nước và với chitinase từ chủng nấm L. Hỗn hợp chitin của rệp được xử lý với nước và rChit từ nấm men P. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm của bào tử nấm L. Mô hình lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm và biểu đồ thể hiện khả năng diệt rệp bằng bào tử của chủng nấm L.

92 xii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2. Các môi trường thí nghiệm. Các điều kiện nuôi cấy chủng nấm L. lecanii 43H sinh tổng hợp chitinase.

Thành phần gel cô và gel tách. Quan hệ giữa 1/[S] và 1/V. Các cặp mồi sử dụng. Thành phần PCR.

Kết quả tinh sạch chitinase từ chủng nấm L. Ảnh hưởng của ion kim loại và EDTA đến hoạt tính chitinase. Hoạt tính chitinase của các dòng nấm men P. pastoris X33/pPChit tái tổ hợp.

Hoạt tính rChit ở các môi trường biểu hiện khác nhau. Kết quả tinh sạch rChit từ nấm men P. Ảnh hưởng của các ion kim loại và EDTA lên hoạt tính rChit. 82 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1.

Đặt vấn đề tâm nghiên cứu. Các chế phẩm sinh học từ nấm ra đời đã được sử dụng để diệt trừ các loại sâu. Cùng với sự phát triển kinh tế - nhanh và chỉ diệt các loài côn trùng có hại mà không ảnh hưởng tới nguồn nước, môi trường sinh thái và sức khỏe con người, vật nuôi. Nấm kí sinh côn trùng thường tác động đến những loại mô nhất định như tuyến mỡ và các mô khác bị hòa tan là do các enzyme (chitinase, protease) của nấm.

Trong quá trình tác động lên côn trùng, nấm tiết ra các enzyme càng mạnh thì tốc độ hủy hoại và tiêu diệt côn trùng gây bệnh càng nhanh, tiết kiệm được thời gian. Dựa vào đặc tính này của nấm, việc tạo ra một lượng lớn enzyme đặc biệt là chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học là rất cần thiết. Chitinase là enzyme thuỷ phân chitin thành các đơn phân N-acetyl glucosamine, chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1,4-glucoside giữa C1 và C4 của 2 phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Chitinase có ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực nông nghiệp, y học.

Từ thực tế trên, việc nghiên cứu đặc tính chitinase và qui trình tạo ra chitinase cao góp phần làm tăng hiệu quả của chế phẩm bào tử nấm là rất cần thiết. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.