Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha tái tổ hợp của viru

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Vân NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN HEMAGGLUTININ (HA) TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRÊN CÂY THUỐC LÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH MIỄN DỊCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Vân NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN HEMAGGLUTININ (HA) TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRÊN CÂY THUỐC LÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH MIỄN DỊCH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Lê Thanh Hoà Hà Nội – 2021 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô giáo, TS. Vũ Huyền Trang và GS. Lê Thanh Hoà đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Chu Hoàng Hà, PGS. Phạm Bích Ngọc, Ths. Hồ Thị Thương, ThS.

Nguyễn Thu Giang, KTV. Trần Thị Loan cùng tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, phòng công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện làm việc, hỗ trợ kinh phí, nhiệt tình giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. Udo Conrad, TS.

Phan Trọng Hoàng, Viện nghiên cứu di truyền và cây trồng thực vật (IPK) CHLB Đức đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện IPK cũng như trong thời gian tôi học tập tại Việt Nam. Tôi xin cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Xuân Hạnh Công ty CP thuốc thú y Ttrung ương NAVETCO đã giúp đỡ tôi thực hiện thành công các thí nghiệm công cường độc trên gà. Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam với đề tài Nghị định thư mã số NĐT.15 và Bộ giáo dục và nghiên cứu CHLB Đức với đề tài “Plantfluvac” mã số 031A283 đã hỗ trợ kinh phí cho tôi thực hiện các nghiên cứu trong luận án này.

Tôi xin cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bộ phận Đào tạo, các phòng chức năng và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và bảo vệ luận án. Cuối cùng, tôi xin dành lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Phạm Thị Vân ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Phạm Thị Vân iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.

i LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT. vi DANH MỤC CÁC BẢNG.

vii DANH MỤC CÁC HÌNH. viii MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của luận án. Mục tiêu nghiên cứu của luận án.

Các nội dung nghiên cứu chính của luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Phân loại và đặc tính của virus cúm A/H5N1. Cấu trúc, chức năng hệ gen của virus cúm A.

Cấu trúc, chức năng của protein hemagglutinin. Biến đổi thành phần hemagglutinin tạo nên các clade của virus A/H5N1. Bệnh cúm gia cầm. Lịch sử và tình hình dịch cúm A/H5N1 trên thế giới.

Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam. Vaccine phòng bệnh cúm cho gia cầm. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm trên thế giới. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam.

Nghiên cứu vaccine cúm phổ rộng. Nghiên cứu vaccine từ thực vật. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA ELP hoá. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA oligomer hoá.

Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp tạm thời ở thực vật thông qua Agrobacterium (agroinfiltration). Ứng dụng agroinfiltration trong nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học trên thế giới. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học thông qua agroinfiltration ở Việt Nam. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Nguồn vật liệu thực vật. Chủng vi sinh vật, plasmid, trình tự gen. Các cặp mồi sử dụng. Nguồn vật liệu động vật.

Môi trường và đệm. Phương pháp. Phương pháp lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1. Phương pháp sử dụng trong thiết kế cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá.

Phương pháp tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp. Phương pháp đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1….

Thu thập và phân loại trình tự HA theo từng năm. Phân tích đổi mã gen và tổng hợp nhân tạo chuỗi gen mã hóa kháng nguyên HA của chủng virus cúm A/H5N1 trên cơ sở những trình tự đã biến đổi. Thiết kế trình tự HA COBRA đại diện các chủng virus cúm A/H5N1 quan tâm. Chuyển đổi các trình tự amino acid của kháng nguyên HACOBRA1 và HACOBRA2 thành các trình tự nucleotide.

Phân tích và so sánh trình tự của các protein HA lựa chọn trong nghiên cứu…. Thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA trimer. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP.

Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer TP. Lựa chọn điều kiện thích hợp cho sự biểu hiện kháng nguyên HA trên cây thuốc lá. Đánh giá sự biểu hiện các kháng nguyên HA tái tổ hợp trong dịch chiết thô thuốc lá. Đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA trong dịch chiết thô lá thuốc lá.

Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp. Tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP từ cây thuốc lá bằng mITC. Tinh sạch kháng nguyên HA trimer và oligomer TP bằng IMAC. Trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA sau tinh sạch.

Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. Miễn dịch trên chuột thí nghiệm. Miễn dịch trên gà thí nghiệm. Lựa chọn gen HA là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam.

HA trimer dung hợp ELP làm tăng cường sự biểu hiện protein trong thực vật, đơn giản hoá trong tinh sạch nhưng không làm tăng cường hoạt tính sinh học của HA trimer. HA COBRA đã kích thích tạo ra kháng thể trung hoà phổ rộng trên động vật thí nghiệm. HA oligomer có hoạt tính sinh miễn dịch cao trên động vật. Dịch chiết thô thuốc lá chứa kháng nguyên HA oligomer TP có thể sử dụng làm ứng viên vaccine phòng bệnh cúm A trên động vật.

129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 131 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN. 132 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ. 133 TÀI LIỆU THAM KHẢO.

P1 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT bp base pair BS3 bis [sulfosuccinimidyl] suberate DNA deoxyribonucleic acid dNTP deoxyribonucleotide triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA ethylene diamine tetra-acetate acid ELISA enzyme-linked immunosorbent assay ELP elastin-like polypeptides EtBr ethidium bromide FAO The Food and Agriculture Organization HA Hemagglutinin HI hemagglutinin inhibition IMAC Immobilized metal ion chromatography kb kilobase kDa kilodalton LB Luria and Bertani mITC membrane-based inverse transition cycling OD optical density OIE The World Organisation for Animal Health PCR polymerase chain reaction SDS sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SEC size exclusion chromatography TAE tris acetate EDTA Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase v/p vòng/phút WHO World Health Organization vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Các gốc amino acid ở các vị trí điểm cắt protease, vị trí bám dính thụ thể, vị trí liên kết thụ thể, vị trí epitope và một vị trí glycosyl hoá bị biến đổi của các H5 từ một số chủng virus A/H5N1 khác nhau. Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 phát triển vaccine.

Các protein có hoạt tính sinh học, kháng thể và vaccine được sản xuất từ thực vật đang trong thử nghiệm lâm sàng hoặc có mặt trên thị trường. Danh sách mồi sử dụng trong nghiên cứu. Số lượng trình tự gen HA của các chủng virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên gia cầm ở Việt Nam. Các vị trí sai khác khi so sánh các trình tự protein HACOBRA clade 1.

Các vị trí sai khác khi so sánh các trình tự protein HACOBRA clade 2. Danh sách các cấu trúc vector thiết kế chứa HA tự nhiên và nhân tạo. Hiệu suất thu hồi các kháng nguyên HA oligomer ELP. Bảng tổng hợp kết quả thiết kế, biểu hiện và đánh giá hoạt tính của các kháng nguyên HA tái tổ hợp.

Trình tự amino acid tại các vị trí phân cắt protein, liên kết thụ thể epitope kháng nguyên và vị trí glycosyl của các protein HA. 124 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Sơ đồ cấu trúc của virus cúm A [8]. Mô hình cấu trúc hemagglutinin xuyên lớp màng bao lipid kép.

Dòng thời gian xuất hiện các clade của A/H5N1 dựa vào trình tự của gen HA ở Việt Nam [1]. Bản đồ các ổ dịch cúm A/H5N1 xảy ra ở các năm 2006 đến 2014 dựa vào số liệu được báo cáo trên OIE. Bản đồ các ổ dịch cúm A/H5N1 xảy ra ở các năm 2015 đến 2017 dựa vào số liệu được báo cáo trên OIE .