Luận án tiến sĩ nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein a20 và cơ chế

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NCS. Nguyễn Thu Thuỷ NGHIÊN CỨU VAI TRÒ ĐIỀU HOÀ CỦA GEN MÃ HOÁ PROTEIN A20 VÀ CƠ CHẾ PHÂN TỬ THAM GIA KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH SINH LÝ TẾ BÀO TUA LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – Năm 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NCS. Nguyễn Thu Thuỷ NGHIÊN CỨU VAI TRÒ ĐIỀU HOÀ CỦA GEN MÃ HOÁ PROTEIN A20 VÀ CƠ CHẾ PHÂN TỬ THAM GIA KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH SINH LÝ TẾ BÀO TUA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Nguyễn Thị Xuân - Viện nghiên cứu hệ gen 2.

Hoàng Văn Tổng - Học viện quân y Hà Nội – Năm 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án là công trình nghiên cứu của tôi là chủ yếu. Nghiên cứu được thực hiện trong khuôn khổ đề tài Nafosted mã số 108.16, “Nghiên cứu vai trò điều hòa của gen mã hóa cho protein A20 với bệnh bạch cầu cấp tính và các cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào”, thời gian thực hiện 2017-2019 do TS. Nguyễn Thị Xuân làm chủ nhiệm đề tài. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và quốc tế với sự đồng ý và cho phép của đồng tác giả.

Những kết quả còn lại trong luận án chưa được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2020 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thu Thuỷ LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Xuân, Phòng Hệ gen học miễn dịch, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam là người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình tôi thực hiện luận án. Đó là nền tảng, hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con đường khoa học sau này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Hoàng Văn Tổng, Phòng An toàn sinh học, Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y, thầy không chỉ truyền thụ cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học.

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS Nguyễn Huy Hoàng, Viện trưởng Viện Nghiên cứu hệ gen và các thầy cô, các anh chị ở Viện đã luôn hướng dẫn tận tình cho tôi trong các môn học cũng như phương pháp thực nghiệm và trình bày kết quả. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Thanh Ngân, đã luôn động viên và dành cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong trong suốt thời gian qua. Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn trong Phòng Hệ gen học miễn dịch đã luôn bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ nhiệt tình để tôi hoàn thành tốt các thí nghiệm của mình.

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các anh chị ở phòng Đào tạo nói riêng và Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam nói chung, đã luôn hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện luận án. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến lãnh đạo các cấp và đồng nghiệp ở Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y, đã tạo điều kiện và động viên giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập, nghiên cứu của mình. Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho gia đình, người thân, bạn bè đã luôn tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong suốt thời gian qua, giúp tôi hoàn thành tốt luận án này. Nghiên cứu sinh DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ APC Antigen-presenting cell – tế bào trình diện kháng nguyên bp Base pairs – cặp Nucleotide DISC Death-inducing signaling complex – phức hợp tín hiệu gây chết ELISA Enzym - Linked Immunosorbent Assay FLT3 Fms-related tyrosine kinase 3 ligand GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor IL Interleukin IFN Interferon IκB-α Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B- cells inhibitor, alpha LPS Lipopolysaccharide MHC Major histocompatipility complex – phức hệ phù hợp tổ chức chính NF-κB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NK cell Natural killer cell – tế bào giết tự nhiên pDC Plasmacytoid DC – tế bào tua dòng lympho STAT Signal transducer and activator of transcription - yếu tố truyền tín hiệu và hoạt hoá phiên mã TBT Tế bào tua TgPRF Profilin từ Toxoplasma gondii T.

gondii Toxoplasma gondii Th1 T helper cell type 1 - tế bào T hỗ trợ loại 1 T-reg T regular - tế bào T điều hoà TLR Toll-like receptor TNFAIP3 Tumor necrosis factor α-induced protein 3 – Protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3 TNF Tumor necrosis factor – yếu tố hoại tử u DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Các bộ kit tách chiết, các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu 34 Bảng 2.2 Các thiết bị chính được sử dụng cho nghiên cứu 36 Bảng 2.3 Pha loãng protein chuẩn theo dải nồng độ chuẩn 45 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế Bảng 3.1 52 bào CD8+DC khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế Bảng 3.2 54 bào CD11b+DC khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế Bảng 3.3 56 bào pDC khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế Bảng 3.4 59 bào CD8+DC sau khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế Bảng 3.5 61 bào CD11b+DC sau khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế Bảng 3.6 62 bào pDC sau khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế Bảng 3.7 65 bào CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của các nhóm tế Bảng 3.8 67 bào tua sau khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của tế bào Bảng 3.9 69 CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự apoptosis của tế bào CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS và một số cytokine, Bảng 3.10 72 khảo sát bằng tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính với Annexin V, âm tính với 7-AAD Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự apoptosis của tế bào Bảng 3.11 CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS và một số cytokine, 74 khảo sát bằng tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính với Caspase-3 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế Bảng 3.12 bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm 84 profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế Bảng 3.13 bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm 86 profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của tế bào pDC Bảng 3.14 89 thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm profilin Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế Bảng 3.15 90 bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của tế bào Bảng 3.16 92 CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc gen A20 và protein A20 4 Hình 1.2 Vai trò của protein A20 trong các tế bào miễn dịch 5 Hình 1.3 Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB trong con đường tín hiệu 10 TNFR1 Hình 1.4 Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB trong các đường hiệu IL- 11 1R/TLR4 Hình 1.5 Tế bào tua chuột phân lập từ lách 17 Hình 1.6 Vòng đời của các tế bào tua 18 Hình 1.7 Tế bào tua và chức năng điều hòa miễn dịch 20 Hình 1.8 Sự biệt hóa đa dạng của tế bào tua 23 Hình 1.9 TLR điều hoà hoạt động hệ thống miễn dịch 29 Hình 2.1 Sơ đồ nhóm thí nghiệm thứ nhất - các tế bào tua biệt hóa bằng 38 FLT3 và phơi nhiễm với profilin Hình 2.2 Sơ đồ nhóm thí nghiệm thứ hai - các tế bào tua biệt hóa bằng 39 GM-CSF và phơi nhiễm với LPS Hình 2.3 Pha loãng protein chuẩn theo dải nồng độ chuẩn 46 Hình 3.1 Kết quả biểu hiện protein A20 sau khi đưa A20-siRNA vào tế 50 bào tua Hình 3.2 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế 53 bào CD8+DC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.3 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của 55 CD11bDC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.4 Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế 57 bào pDC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.5 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào 60 CD8+DC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.6 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào 61 CD11bDC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.7 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào 64 pDC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.8 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào 66 CD11b+DC khi phơi nhiễm với LPS Hình 3.9 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển của các nhóm tế 68 bào tua khi biệt hoá bởi FLT3 và phơi nhiễm profilin Hình 3.10 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển của nhóm tế bào 70 CD11b+DC khi biệt hoá bởi GM-CSF và phơi nhiễm LPS Hình 3.11 Ảnh hưởng của protein A20 đối với apoptosis thông qua số 73 lượng tế bào CD11b+DC dương tính với marker Annexin V và âm tính với 7-AAD Hình 3.12 Ảnh hưởng của protein A20 đối với apoptosis thông qua tỷ lệ 75 tế bào CD11b+DC dương tính với marker Caspase-3 Hình 3.13 Ảnh hưởng của protein A20 lên con đường tín hiệu IκB-α, 77 STAT1 và STAT3 ở tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.14 Ảnh hưởng của protein A20 lên con đường tín hiệu IκB-α, 79 STAT1 và STAT3 ở tế bào pDC khi phơi nhiễm profilin Hình 3.15 Ảnh hưởng của protein A20 lên con đường tín hiệu IκB-α, 82 STAT1 và STAT3 ở tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm LPS Hình 3.16 Ảnh hưởng của protein A20 lên biểu hiện của marker trưởng 84 thành của tế bào pDC thông qua con đường tín hiệu IκB-α và STAT1 Hình 3.17 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào 87 pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 Hình 3.18 Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển tế bào pDC 89 thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 Hình 3.