Luận án tiến sĩ sinh học nghiên cứu tạo chủng vi khuẩn vibrio parahaemolyticus đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI VŨ THỊ BÍCH HUYỀN NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG VI KHUẨN Vibrio parahaemolyticus ĐỘT BIẾN GIẢM ĐỘC LỰC NHẰM PHÁT TRIỂN VẮC-XIN PHÒNG BỆNH HOẠI TỬ GAN THẬN TRÊN MỘT SỐ LOÀI CÁ BIỂN Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 9.21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1: PGS. Nguyễn Xuân Viết 2: PGS. Phạm Thị Tâm HÀ NỘI- NĂM 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi là Vũ Thị Bích Huyền, nghiên cứu sinh khóa K34 Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, chuyên ngành Di truyền học, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.

Nguyễn Xuân Viết và PGS. Phạm Thị Tâm. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực.

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng năm Nghiên cứu sinh Vũ Thị Bích Huyền LỜI CẢM ƠN Để thực hiện và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, hỗ trợ, giúp đỡ cũng như quan tâm, động viên từ nhiều cơ quan, tổ chức, cá nhân. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn trân trọng nhất đến hai thầy, cô giáo kính mến của mình, PGS. Nguyễn Xuân Viết (Trường Đại học Sư phạm Hà Nội) và PGS.

Phạm Thị Tâm (Viện Đại học Mở Hà Nội). Thầy cô là người trực tiếp hướng dẫn khoa học, tận tình chỉ bảo, định hướng, truyền đạt kiến thức cũng như kinh nghiệm nghiên cứu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Thầy cô luôn luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể hoàn thành luận án này. Tôi xin cảm ơn nhóm nghiên cứu đã nhiệt tình hỗ trợ tôi thực hiện đề tài của mình bao gồm Th.S Mẫn Hồng Phước (Viện Công nghệ sinh học), Th.S Cao Thị Thanh Hương, ThS.

Nguyễn Thị Hải Yến; Th.S Huỳnh Việt Tùng, ThS. Đặng Thị Hồng Thắm và các sinh viên Đỗ Thanh Vân, Nguyễn Đăng Quang (ĐHSPHN), Đàm Thận Quảng, Nguyễn Mạnh Hùng, Hà Huy Tùng (Viện ĐH Mở HN). Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các cán bộ - giảng viên - sinh viên trong bộ môn Di truyền học - Hóa Sinh, các cán bộ - giảng viên Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã ủng hộ tạo điều kiện để tôi có thể thực hiện các nội dung trong đề tài. Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban chủ nhiệm Khoa Sinh học, Phòng Tổ chức cán bộ, Phòng Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và hoàn thành chương trình học Nghiên cứu sinh tại Trường.

Tôi xin cảm ơn tập thể cán bộ - giảng viên - sinh viên Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội đã tạo điều kiện, giúp đỡ, chia sẻ khó khăn để tôi có thể triển khai thuận lợi các nội dung của đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất đến gia đình và bạn bè đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm Nghiên cứu sinh Vũ Thị Bích Huyền DANH MỤC VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ và nghĩa Việt 1 A Adenine 2 Ala Alanine 3 Asn Asparagine 4 Asp Aspartic acid 5 bp Base pair 6 BHI Brain Heart Infusion 7 CFU Colony Forming Units 8 C Cytosine 9 DNA Deoxyribonucleic acid (axit nucleic) 10 Gln Glutamine 11 Glu Glutamic acid 12 Gly Glycine 13 G Guanine 14 His Histidine 15 Ile Isoleucine 16 KIA Kligler Iron Agar 17 KP Kanagawa phenomenon 18 Leu Leucine 19 LPS Lipopolysaccharides 20 LD50 Lethal dose (Liều gây chết trung bình) 21 LB Luria Broth 22 Met Methionine 23 NCBI National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Thông tin Công nghệ sinh học Quốc gia) 24 Phe Phenylalanine 25 PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) 26 Pro Proline 27 OMPs Outer membrane proteins (Protein màng ngoài) 28 ORF Open reading frame (Khung đọc mở) 29 PBS Phosphate buffered saline 30 RRDR Rifampicin-resistance determining region (Vùng xác định kháng rifampicin) 31 RNA Ribonucleic acid 32 Ser Serine 33 TRH TDH-related haemolysin 34 TDH Thermostable direct haemolysin 35 TLH Thermolabile haemolysin 36 TCBS Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose 37 Thr Threonine 38 RPS Relative percent survival (Tỉ lệ bảo hộ) 39 T Tymine 40 Tyr Tyrosine 41 Val Valine 42 & cs Và cộng sự 42 VPGs Vibrio parahaemolyticus ghosts MỤC LỤC MỞ ĐẦU. Lý do chọn đề tài.

Mục tiêu nghiên cứu. Nội dung nghiên cứu. Đối tượng nghiên cứu. Phạm vi nghiên cứu.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài. Tính mới, tính độc đáo của đề tài. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. 5 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.

Tổng quan về vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan thận ở một số loài cá. Đặc điểm hình thái, sinh hóa và sinh trưởng của vi khuẩn Vibrio. Hệ gen của vi khuẩn V. Độc tố và các gen quy định độc tố haemolysin.

Gen rpoB và tính kháng rifampicin. Kháng nguyên của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus. Bệnh hoại tử gan thận trên cá biển. Chẩn đoán và điều trị.

Vắc-xin và cơ chế miễn dịch chủ động. Vắc-xin và phân loại vắc-xin cho cá. Miễn dịch đặc hiệu ở cá xương. Phương thức đưa vắc-xin vào cơ thể cá.

Nghiên cứu tạo vi khuẩn giảm độc lực phục vụ sản xuất vắc-xin nhược độc phòng bệnh cho cá. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân vật lý. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng tác nhân hóa học. Tạo vi khuẩn giảm độc lực bằng kĩ thuật gen.

Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc-xin phòng bệnh hoại tử gan thận do cho cá. Tình hình nghiên cứu trên thế giới. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam. 38 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Vật liệu nghiên cứu. Phương pháp nghiên cứu. Sơ đồ các bước thực hiện chính. Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn Vibrio từ cá nghi mắc bệnh.

Phương pháp giữ giống chủng vi khuẩn. Phương pháp nhuộm Gram. Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn. Phương pháp đánh giá đặc điểm sinh hóa, đặc tính kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn.

Phương pháp đánh giá độc lực của vi khuẩn. Phương pháp xử lý vi khuẩn với rifampicin. Phương pháp đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin. Nhóm phương pháp sinh học phân tử.

Phương pháp thiết kế mồi. Phương pháp tách DNA tổng số. Phương pháp PCR, giải trình tự gen. Phương pháp tin sinh.

Phương pháp đánh giá tính ổn định về độc lực và độ an toàn của dòng vi khuẩn giảm độc lực trên cá mú chấm cam. Phương pháp đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của dòng giảm độc lực trên cá mú. Phương pháp xử lý số liệu. 54 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Phân lập chủng vi khuẩn từ mẫu cá biển nghi mắc bệnh hoại tử gan thận. Phân lập vi khuẩn Vibrio. Phân tích đặc điểm sinh hóa của các mẫu vi khuẩn phân lập. Xác định chủng vi khuẩn V.

parahaemolyticus bằng phương pháp phân tử. Đánh giá khả năng gây bệnh cho cá mú của các chủng vi khuẩn phân lập. Phân lập, giải trình tự các gen độc tố toxR, tlh và gen rpoB các chủng vi khuẩn phân lập. Kết quả tạo dòng vi khuẩn V.

parahaemolyticus giảm độc lực. Đánh giá độc lực của các dòng vi khuẩn kháng rifampicin. Đánh giá đặc điểm sinh hóa của các dòng vi khuẩn giảm độc lực. So sánh trình tự gen toxR, tlh và rpoB của các dòng giảm độc lực so và chủng vi khuẩn dại.

So sánh trình tự gen toxR và tlh của dòng giảm độc lực và chủng vi khuẩn dại. So sánh trình tự rpoB của chủng dại với các dòng giảm độc lực. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch, khả năng sinh trưởng của dòng vi khuẩn giảm độc lực. Đánh giá tính ổn định độc lực, khả năng sinh trưởng của dòng giảm độc lực.

Xác định tính an toàn của dòng L4650. Đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của dòng vi khuẩn giảm độc lực ở cá mú. 107 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 113 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ.

114 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 115 Tài liệu tiếng Việt. 115 PHỤ LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 2. Sơ đồ các bước thực hiện chính.

Tiêm truyền dịch khuẩn gây nhiễm bệnh cho cá mú. Khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập trên môi trường TCBS. Phản ứng lên men trên môi trường KIA (A) và phản ứng sinh indol với thuốc thử Kovac (B) của các mẫu vi khuẩn. Vi khuẩn VCTT 12233 (A) và HH3.34 (B) sinh enzym catalase làm sủi bọt khi thử nghiệm với H2O2.

Vi khuẩn LBT6 gây hiện tượng tan huyết trên môi trường thạch máu (A) và có khả năng di động trên môi trường LB bán lỏng (B) .1 nuôi trên BHI agar với 5 đĩa giấy kháng sinh. DNA tổng số của các vi khuẩn điện di trên gel agarose. Sản phẩm PCR khuếch đại gen toxR của các mẫu vi khuẩn với cặp mồi toxR-4, toxR-7. Sản phẩm PCR (~450 bp) khuếch đại gen tlh của các mẫu vi khuẩn với cặp mồi tlhF-tlhR.

Cá mú chết ở ngày thứ 3 sau gây nhiễm chủng LBT6 (A) và ở ngày thứ 9 sau gây nhiễm chủng LBT6 với hiện tượng nội tạng bị tổn thương nghiêm trọng (B). Sản phẩm PCR (~1000 bp) khuếch đại gen toxR của các chủng vi khuẩn với cặp mồi toxR2, toxR4. So sánh hai trình tự gen toxR của chủng LBT6 được khuếch đại bởi 2 cặp mồi toxR2-toxR4 (LBT6-toxR-seqA) và toxR-4, toxR-7 (LBT6-toxR-seqB). Sơ đồ minh họa các đoạn trình tự gen toxR của các chủng V.

parahaemolyticus trên NCBI với trình tự tương ứng trên gen toxR hoàn chỉnh của chủng phân lập BLT6/A3. Sản phẩm PCR (~1500 bp) khuếch đại gen tlh của các chủng vi khuẩn với cặp mồi tlh1- tlh3. So sánh hai trình tự gen tlh của chủng LBT6 được khuếch đại bởi 2 cặp mồi tlhF - tlhR (LBT6-tlh-seqA) và tlh1-tlh3 (LBT6-tlh-seqB). Sơ đồ minh họa các đoạn trình tự gen tlh của các chủng V.

parahaemolyticus trên NCBI với trình tự tương ứng trên gen tlh hoàn chỉnh của chủng phân lập BLT6/A3. Sản phẩm PCR (~984 bp) gen rpoB của các chủng vi khuẩn với cặp mồi 1110F-CM32b. Tỉ lệ sống sót của cá ngựa vằn sau gây nhiễm với các dòng vi khuẩn phát sinh từ chủng dại A3. Cá ngựa vằn chết do nhiễm khuẩn A3.