Luận án tiến sĩ nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- NCS. Lê Thị Thơm Đề tài: “NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA 3 - 6 TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VIỆT NAM Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI” Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. Đặng Diễm Hồng Hà Nội – 2021 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS. Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng Phòng Công nghệ Tảo - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng, chỉ bảo tận tình những kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ về tinh thần, vật chất, động viên tôi vượt qua nhiều trở ngại và khó khăn để hoàn thành luận án trong suốt những năm qua.

Tôi trân trọng cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, phòng đào tạo của học Viện Khoa học và Công nghệ cùng các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đồng nghiệp đã và đang công tác tại phòng Công nghệ Tảo: TS. Hoàng Thị Minh Hiền, TS. Ngô Thị Hoài Thu, TS.

Hoàng Thị Lan Anh, TS. Lưu Thị Tâm, TS. Nguyễn Cẩm Hà, ThS. Đinh Thị Ngọc Mai ….

đã cho tôi những lời khuyên chân thành, đã đóng góp ý kiến và giúp đỡ tôi hoàn chỉnh số liệu trong luận án này. Tôi xin cảm ơn Khoa Dược lý – Học viện Quân Y đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm, TS. Đoàn Lan Phương – Viện Hóa học Các hợp chất Thiên nhiên - phân tích hàm lượng các axít béo, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng - kiểm tra chất lượng của dầu, Công ty Cổ phần Dược phẩm Novaco - bao viên, đóng gói và hoàn thiện sản phẩm. Luận án được thực hiện trong khuôn khổ đề tài cấp Bộ Công Thương “Nghiên cứu quy trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo omega-3 và omega-6 (EPA, DHA, DPA) từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng” năm 2013 - 2015 thuộc Đề án phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 do PGS.

Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình. Hà Nội, ngày tháng năm 20 Nghiên cứu sinh Lê Thị Thơm ii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả.

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 20 Tác giả Lê Thị Thơm ix DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của DHA…………… 5 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học (A) và cấu trúc không gian (B) của EPA………….3 Cấu trúc hóa học của ω-6 DPA (A) và ω-3 DPA (B)………………….4 Sản xuất axit béo omega - 3 từ các nguồn khác nhau ………………….5 Sơ đồ tách chiết PUFAs từ vi tảo và lợi ích của nó đối với con người… 12 Hình 1.6 Con đường sinh tổng hợp PUFAs ở thực vật, động vật và con người….7 Mối quan hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và docosahexaenoic acid (DHA) ở Thraustochytrids…………………………………………….8 Sinh tổng hợp DHA theo con đường hiếu khí ở Thraustochytriidae….9 Sinh tổng hợp DHA theo con đường PKS ở Thraustochytriidae…….10 Vòng đời và sơ đồ tóm tắt các dạng tế bào trong chu kỳ sống của thraustochytrid và labyrinthulid……………………………………….11 Vị trí phân loại của chi Schizochytrium.12 Sơ đồ tổng quát của nhân nuôi sinh khối theo mẻ, theo kiểu fed-batch, liên tục và động học tăng trưởng của các quá trình nhân nuôi sinh khối tương ứng……………………………………………………………….13 Sơ đồ tổng quát hoạt động của các chất chống oxy hóa……………….1 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu dầu sinh học giàu ω 3 - 6 từ Schizochytrium mangrovei TB17 58 Hình 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của chủng TB17………….2 Ảnh hưởng của độ mặn lên sinh trưởng của chủng TB17…………….3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên sinh trưởng của chủng TB17…….4 Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng của chủng TB17….5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng của chủng TB17………….6 Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng của chủng TB17 65 Hình 3.7 Ảnh hưởng của pH môi trường môi trường lên sinh trưởng của chủng TB17…………………………………………………………………….8 Ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sinh trưởng của chủng TB17 66 Hình 3.9 MĐTB, SKK và hàm lượng lipit của chủng TB17 trong bình tam giác 1 Lit…………………………………………………………………….10 Ảnh hình thái tế bào chủng TB17 nhân nuôi sinh khối trong bình tam giác 1 Lit……………………………………………………………….11 MĐTB và SKK của chủng TB17 trong hệ thống lên men 5 và 10 Lit… 68 Hình 3.12 Hàm lượng glucose còn dư trong môi trường nuôi và lipit của chủng TB17 trong hệ thống lên men 5 và 10 Lit….13 Sinh trưởng của chủng TB17 trong các môi trường nhân nuôi sinh khối khác nhau……………………………………………………………… 74 Hình 3.14 Sự thay đổi thể lipit trong quá trình nhân nuôi sinh khối theo mẻ…….15 Sự thay đổi thể lipit trong quá trình nhân nuôi sinh khối kiểu fed-batch.16 Ảnh hưởng của các phương pháp thu hoạch sinh khối đến sinh khối tươi (A) và MĐTB tảo trong môi trường sau thu hoạch (B)…………… 80 Hình 3.17 MĐTB tảo trong môi trường nuôi sau thu hoạch bằng chitosan ở các nồng độ khác nhau…………………………………………………….18 Ảnh minh họa quá trình thu sinh khối bằng chitosan ở các nồng độ khác nhau……………………………………………………………….19 Ảnh hưởng của phương pháp tách chiết lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối khô của chủng TB17………………………………………… 83 Hình 3.20 Ảnh hưởng của các loại dung môi lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối khô của chủng TB17………………………………………….21 Ảnh hưởng của phương pháp sấy sinh khối lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối khô của chủng TB17…………………………………….22 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối khô của chủng TB17……………………………………………… 84 Hình 3.23 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối khô của chủng TB17……………….24 Ảnh hưởng của chế độ khuấy lên hiệu suất tách chiết lipit từ sinh khối khô của chủng TB17……………….25 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH (A), thời gian phản ứng (B) và nhiệt độ phản ứng (C) lên hiệu suất xà phòng hóa dầu tảo……………………… 87 Hình 3.26 Ảnh hưởng của tỉ lệ FFA: urea (A), tỉ lệ Urea: ethanol (B) và nhiệt độ kết tinh (C) lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs của hỗn hợp axit béo tự do……………………………………………………… 91 Hình 3.27 Ảnh hưởng của chất xúc tác lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối khô của chủng TB17………………………………………………….28 Ảnh hưởng của tỉ lệ dung môi/ sinh khối lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối khô của chủng TB17……………………………………… 95 Hình 3.29 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối khô của chủng TB17……………………………………………… 96 Hình 3.30 Ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên hiệu suất tách chiết TFA từ sinh khối khô của chủng TB17…………………………………………….31 Ảnh hưởng của tỷ lệ TFA: urea lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs………………………………………………………………….32 Ảnh hưởng của tỷ lệ Urea: methanol lên hiệu suất tạo phức và hiệu suất tách PUFAs……………………………………………………… 98 Hình 3.33 Thành phần axít béo trong dầu ở dạng FFA và methyl este từ các nguồn SKT và SKK…………………………………………………… 102 Hình 3.34 Ảnh hưởng của nhiệt độ nước rửa đến hiệu suất thu hồi và pH mẫu dầu thu được…………………………….35 Ảnh hưởng của số lần rửa nước đến hiệu suất thu hồi và pH mẫu dầu thu được…………………………….36 Quy trình tách chiết dầu giàu axít béo ω 3 - 6 PUFAs dạng methyl este từ SKK chủng S. mangrovei TB17 theo phương pháp tạo phức urea….37 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa BHA lên chỉ số peroxide của dầu sinh học ω 3 - 6………………………………….38 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa BHT lên chỉ số peroxide của dầu sinh học ω 3 - 6………………………………….39 Ảnh hưởng của các chất chống oxy hóa TBHQ lên chỉ số peroxide của dầu sinh học ω 3 - 6………………………………….40 Ảnh hưởng của hỗn hợp 3 chất bảo quản theo tỷ lệ 1:1:1 (B) lên chỉ số peroxide của dầu sinh học ω 3 - 6………………………………….41 Ảnh hưởng của vitamin E nồng độ 0,0075% lên chỉ số peroxyt của dầu sinh học ω 3 - 6.42 Ảnh hưởng của viên AOO-3-6 đối với hoạt độ AST (A) và ALT (B), hàm lượng Albumin huyết tương (C) và Chlesterol toàn phần (D)…….43 Hình ảnh đại thể gan, thận, lách chuột lô đối chứng (A), lô TN1 (B) và lô TN2 (C)……………………………………………………………… 121 Hình 3.44 Hình ảnh mô bện học vi thể gan, thận, lách chuột sau 90 ngày uống thuốc lô đối chứng (A, D, H), lô TN1 (B, E, D) và lô TN2 (C, G, K), tương ứng (HE, x400)………………………………………………… 121 1 MỞ ĐẦU Hiện nay, khi nhu cầu cuộc sống cũng như những đòi hỏi cao hơn về giá trị dinh dưỡng thì con người không chỉ sử dụng các loại dầu ăn thông dụng mà còn cả các loại dầu đặc sản có giá trị cao (dầu salad, dầu chức năng) để phục vụ cho món ăn cao cấp, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người, dược phẩm. Các loại dầu từ thực vật chỉ chứa các axít béo không bão hòa có mạch cacbon ≤ 18.

Trong đó các loại dầu thực vật như dầu lanh, canola và đậu tương chứa các axit béo không bão hòa đa nối đôi dạng omega-3 (polyunsaturated fatty acid omega 3; PUFAs ω-3) chủ yếu là axít α-linolenic (ALA) và các loại dầu khác như dầu bắp, dầu hạt bông vải, dầu nho…lại chứa chủ yếu là PUFAs ω - 6. Đối với các loại axít béo ω-3 có số cacbon lớn hơn 20 và 22 chủ yếu lại có nguồn gốc từ cá biển. Nguồn cung cấp chính các axít béo docosahexaenoic (DHA; C22:6) và eicosapentaenoic (EPA; C20:5) là các loài cá nhiều mỡ như cá trích, cá thu và cá hồi. Tuy nhiên, chất lượng của dầu cá biển tự nhiên lại phụ thuộc vào loài cá, mùa vụ và vị trí đánh bắt.