Nghiên cứu Công nghệ Tách Catechin Chè Xanh, Tạo Dẫn Xuất O-acetyl và Khảo Sát Hoạt Tính Dọn Gốc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM. ĐỖ THANH HÀ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TÁCH CÁC CATECHIN TỪ CHÈ XANH (CAMELLIA SINENSIS L.),CHUYỂN HÓA TẠO DẪN XUẤT O-ACETYL CATECHIN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH DỌN GỐC TỰ DO CỦA CHÚNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM. ĐỖ THANH HÀ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TÁCH CÁC CATECHIN TỪ CHÈ XANH (CAMELLIA SINENSIS L.), CHUYỂN HÓA TẠO DẪN XUẤT O-ACETYL CATECHIN VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH DỌN GỐC TỰ DO CỦA CHÚNG Chuyên ngành: hóa hữu cơ Mã số: 62.14 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1.TSTrần Thị Nhƣ Mai HÀ NỘI – 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án là công trình nghiên cứu của bản thân. Tất cả thông tin tham khảo dùng trong luận án này lấy từ các công trình nghiên cứu có liên quan đều đƣợc nêu rõ nguồn gốc trong danh mục tài liệu tham khảo.

Các kết quả nghiên cứu đƣa ra trong luận án là hoàn toàn trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kì công trình khoa học nào khác. Ngày tháng năm 2017 TÁC GIẢ LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tập thể hƣớng dẫn TS. Hoàng Văn Hoan – Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam và PGS. Trần Thị Nhƣ Mai – Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên đã hƣớng dẫn tôi trong mọi khía cạnh học thuật của luận án này.

Xin chân thành cảm ơn các cán bộ của Trung tâm Hóa dƣợc, Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam đã luôn hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Xin chân thành cảm ơn Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam đã luôn tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất và thủ tục hành chính cho tôi thực hiện luận án. Xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè, đồng nghiệp đã động viên giúp đỡ tôi hoàn thành luận án này. Tác giả Đỗ Thanh Hà MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ LỜI MỞ ĐẦU VÀ NHIỆM VỤ LUẬN ÁN.

1 CHƢƠNG 1 : TỔNG QUAN. VÀI NÉT VỀ CHÈ XANH. Cây chè - Camellia sinensis (L. Chè xanh trong thực phẩm và dƣợc phẩm.

THÀNH PHẦN HOẠT CHẤT CỦA CHÈ XANH. So sánh chất lƣợng nguyên liệu theo vùng trồng chè xanh ở Thái Nguyên, Phú Thọ, Mộc Châu. Các catechin chè xanh. Các thành phần khác [16].

HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA EGCG VÀ CÁC CATECHIN CHÈ XANH. Cơ chế hoạt động. Hoạt tính chống ôxy hóa. Hoạt tính diệt khuẩn, kháng viêm, kháng virus [45,46,48].

Một số nghiên cứu ứng dụng các catechin phòng và trị ung thƣ [32,33]. Bảo vệ tim mạch [34, 35]. Chống béo phì. Một số tác dụng khác của EGCG và catechin chè xanh.

CÁC NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ HÓA HỌC CHIẾT, TÁCH VÀ ĐIỀU CHẾ CÁC CATECHIN VÀ DẪN XUẤT. Các kỹ thuật công nghệ chiết catechin từ chè xanh. Sắc ký lỏng hiệu năng cao trong phân tích và phân tách catechin. 28 CHƢƠNG 2 : THỰC NGHIỆM.

ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị. Các phƣơng pháp chiết chè xanh.

Phƣơng pháp chiết đun hồi lƣu sử dụng cồn. Phƣơng pháp chiết ngƣợc dòng liên tục dùng nƣớc làm dung môi. Các phƣơng pháp phân tách catechin. Phƣơng pháp acetyl hóa catechin.

Các phƣơng pháp phân tích sản phẩm. Thiết kế nghiên cứu của luận án. Nghiên cứu quy trình chiết suất các catechin tổng số từ chè xanh. Nghiên cứu quy trình chiết suất các catechin tổng số từ chè xanh bằng ethanol.

Nghiên cứu quy trình chiết suất các catechin tổng số từ chè xanh bằng nƣớc trên thiết bị chiết ngƣợc dòng liên tục. Nghiên cứu tách và tinh chế các catechin và EGCG từ catechin tổng số của chè xanh. Nghiên cứu lựa chọn chất hấp phụ có thể tái sử dụng làm pha tĩnh tách sắc ký điều chế EGCG từ catechin tổng số của chè xanh. Nghiên cứu và thử nghiệm quy trình công nghệ tách EGCG lƣợng lớn trên hệ thống sắc ký lỏng MP/HPLC Pilot.

Nghiên cứu phân tách các catechin bằng phƣơng pháp HPLC trên cột sắc ký phối hợp Diaion HP20 và Sephadex LH20. Bán tổng hợp dẫn xuất O-acetyl của các catechin chè xanh và đánh giá mức độ suy giảm hoạt tính dọn gốc tự do. Bán tổng hợp các dẫn xuất acetyl của catechin để đánh giá mức độ suy giảm hoạt tính. Đánh giá mức độ suy giảm hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của các dẫn xuất O-acetyl so với các catechin chè xanh.

Nghiên cứu quy trình tách và tinh chế caffeine từ cao chiết chè xanh. 53 CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CATECHIN TỔNG SỐ TỪ CHÈ XANH. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ chung chiết catechin tổng số từ chè xanh.

Nghiên cứu chiết catechin tổng số bằng ethanol theo phƣơng pháp Soxhlet. Nghiên cứu chiết chè xanh bằng nƣớc theo phƣơng pháp ngƣợc dòng liên tục. NGHIÊN CỨU TÁCH VÀ TINH CHẾ CÁC CATECHIN VÀ EGCG TỪ CATECHIN TỔNG SỐ CỦA CHÈ XANH. Nghiên cứu lựa chọn chất hấp phụ có thể tái sử dụng làm pha tĩnh tách sắc ký điều chế EGCG từ catechin tổng số của chè xanh.

Đánh giá hiệu quả tách EGCG từ catechin tổng số trên cột silica gel biến tính bằng pha động sắc ký. Đánh giá hiệu quả tách EGCG từ catechin tổng số trên cột silica gel pha lƣỡng tính RP/NP. Đánh giá hiệu quả tách EGCG từ tổng catechin trên cột Sephadex LH 20. Đánh giá hiệu quả tách EGCG từ catechin tổng số trên vật liệu polyme xốp có lỗ trống mạng phân tử lớn.

So sánh hiệu quả tách của các phƣơng pháp sắc ký điều chế tách EGCG. Nghiên cứu và thử nghiệm quy trình công nghệ tách EGCG lƣợng lớn trên hệ thống sắc ký lỏng MP/HPLC Pilot. Nghiên cứu ảnh hƣởng của tốc độ dòng pha động đến quá trình tách sắc ký sản xuất EGCG. Nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ khối lƣợng mẫu đầu vào đến quá trình tách sắc ký sản xuất EGCG.

Nghiên cứu phân tách các catechin bằng phƣơng pháp HPLC trên cột sắc ký phối hợp Diaion HP20 và Sephadex LH20. Đánh giá phân đoạn III. Đánh giá phân đoạn V. Đánh giá phân đoạn VI và VII.

BÁN TỔNG HỢP DẪN XUẤT O-ACETYL CỦA CÁC CATECHIN CHÈ XANH VÀ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ SUY GIẢM HOẠT TÍNH DỌN GỐC TỰ DO83 3. Bán tổng hợp các dẫn xuất acetyl của catechin để đánh giá mức độ suy giảm hoạt tính. Hợp chất epi-Catechin acetate (I). Hợp chất epi-Gallocatechin acetate (II).

Hợp chất epi-Gallocatechin gallate, O-octaacetyl (III). Đánh giá mức độ suy giảm hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của các dẫn xuất O-acetyl so với các catechin chè xanh. NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THU NHẬN CAFFEINE TỪ CAO CHIẾT CHÈ XANH. Quy trình tách và tinh chế Caffeine.

Xác định cấu trúc hóa học của caffeine bằng phƣơng pháp phổ. 101 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN. 103 DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢLIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN. 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT C Catechin EC Epicatechin GC Gallocatechin EGC Epigallocatechin ECG Epicatechin gallate EGCG Epigallocatechin gallate CG Catechin gallate GCG Gallo catechin gallate ECDG Epicatechin digallate EGCDG Epigallocatechin digallate 13 C-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân cacbon 1 H-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hidro DEPT Phổ DEPT ( Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer) 2D-NMR Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 2 chiều (Two – dimensional NMR) HSQC Phổ HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence ) HMBC Phổ HMBC ( heteronuclear multiple bond connectivity) d Doublet dd Doublet of doublet m Multipet m/z Tỷ lệ số khối/điện tích ion s Singlet t Triplet EIS-MS Phổ khố lƣợng phun mù điện tử ( Electron Spray Ionization Mass Spectrometry) HPLC-MS Sắc ký lỏng hiệu năng cao kết nối khối phổ MeOH Metanol SKLM Sắc ký lớp mỏng LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp HDL Lipoprotein tỉ trọng cao IC50 Nồng độ ức chế 50% đối tƣợng thử đvC Đơn vị cacbon v Thể tích ROS Reactive oxygen spcecies (gốc tự do oxi hóa) HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời NF-κB Yếu tố Nhân kappa B APP Protein tiền chất của amyloid PKC Protein kinase C MPTP 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,4-tetrahydropyridine 6-OHDA 6-hydroxydopamin DPPH 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl DMSO Dimethylsulfoxyd DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.

1: Ứng dụng của chế phẩm polyphenol chè xanh trong chế biến thực phẩm. 2 : Thành phần cơ học nguyên liệu 1 tôm 3 lá. 3 : Thành phần polyphenol nguyên liệu chè theo vùng và vụ thu hái. 4: Các catechin đã được phân lập trong chè xanh.

5: Hàm lượng các catechin chủ yếu trong các loại chè khác nhau. 6: Thành phần catechin trong các bộ phận chè xanh [16]. 7: So sánh lượng catechin chiết từ chè xanh theo các kỹ thuật sử dụng viba, siêu âm và Soxhlet. 1: Hàm lượng một số catechin trong catechin tổng số.

2: Thành phần catechin tổng số theo phương pháp ngược dòng liên tục. 3: Đánh giá hiệu quả tách sắc ký EGCG. 4: Độ chuyển dịch hóa học của epi-Catechin. 5: Độ chuyển dịch hóa học của epi-Gallocatechin.

6: Độ chuyển dịch hóa học của epi-Gallocatechin gallate. 7: Độ chuyển dịch hóa học (δ) của epi-Catechin acetate. 8: Độ chuyển dịch hóa học (δ) của epi-Gallocatechin acetate. 9: Độ chuyển dịch hóa học của EGCG acetate.

10: Kết quả khảo sát hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của các Catechin và dẫn xuất O-acetyl. 11: Độ dịch chuyển hóa học của Caffeine. 100 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1. Error! Bookmark not defined.

2: Công thức tổng quát của Catechin. 3: Một số cấu trúc Catechin chè xanh điển hình. 4: Quy trình tóm tắt công nghệ chiết Polyphenol chè xanh trên thế giới. 1: Chè nguyên liệu.

2: Hệ thống Pilot Prep. HPLC và cột tách Sephadex ID 100 x L 800 mm. 3: Thiết kế nội dung nghiên cứu. 4: Thiết bị chiết Soxhlet 20 lít.

5: Thiết bị cô quay chân không 20 lít Heidolph Laborota LR 20. 6: Chiết phân bố trên thiết bị chiết tuần hoàn 80 lít. 7: Lọc hút chân không thu catechin tổng số. 8: Hệ thống chiết lỏng/rắn ngƣợc dòng liên tục.

9: Thiết kế máy chiết lỏng/rắn ngƣợc dòng liên tục. 10: Sơ đồ quy trình thu nhận catechin tổng số từ dịch thủy phân. 11: Thiết bị tách sắc ký điều chế MPLC. 12: Hệ thống sắc ký lỏng cao áp điều chế bán công nghiệp.

13: Quy trình công nghệ tách và tinh chế Caffeine. 1: Quy trình chung chiết xuất catechin tổng số từ chè xanh. 2: Sản phẩm catechin tổng số. 3: Sắc ký đồ HPLC/MS phân tích catechin tổng số .