Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trong cây thuốc lá
Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên virus PRRS (m gp5 gp5ectom) trong cây thuốc lá nhờ Agrobacterium.
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Luan An
Luận án tiến sĩ
Năm xuất bản
Số trang
179
Thời gian đọc
27 phút
Lượt xem
0
Lượt tải
0
Phí lưu trữ
50 Point
Tổng quan nhanh
- Chủ đề:
- 1. Biểu hiện kháng nguyên PRRSV: Giải pháp Vắc-xin thực vật
- Số trang:
- 179 trang
- Trường:
- Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
- Chuyên ngành:
- Hóa sinh học
- Tác giả:
- Nguyễn Thị Minh Hằng
- Năm:
- 2018
Tóm tắt nội dung luận án
I. Biểu hiện kháng nguyên PRRSV Giải pháp Vắc xin thực vật
Nghiên cứu tập trung vào việc sản xuất kháng nguyên virus PRRS (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus) trong cây thuốc lá. Mục tiêu là phát triển các phương pháp hiệu quả cho sản xuất vắc-xin. Virus PRRS gây ra thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi toàn cầu. Các vắc-xin hiện có còn tồn tại nhiều hạn chế. Việc tìm kiếm giải pháp mới là cần thiết để kiểm soát dịch bệnh. Hệ thống biểu hiện thực vật cung cấp một nền tảng đầy hứa hẹn. Nền tảng này cho phép sản xuất protein tái tổ hợp quy mô lớn, với chi phí thấp và an toàn. Đặc biệt, cây thuốc lá là một mô hình lý tưởng. Phương pháp này tránh được nguy cơ nhiễm mầm bệnh từ động vật. Công nghệ vắc-xin tiểu đơn vị từ thực vật đang mở ra hướng đi mới. Các vắc-xin này an toàn, ổn định và dễ dàng bảo quản. Chúng không yêu cầu chuỗi lạnh phức tạp. Đây là lợi thế lớn cho việc phân phối vắc-xin đến các khu vực khó khăn.
1.1. Hiểm họa virus PRRS đối với ngành chăn nuôi
Virus PRRS gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Dịch bệnh này là mối đe dọa nghiêm trọng. Nó làm giảm năng suất sinh sản, tăng tỷ lệ tử vong ở lợn con. Thiệt hại kinh tế do PRRSV gây ra là rất lớn. Việc phòng chống PRRSV còn nhiều thách thức. Vắc-xin hiện tại có những hạn chế nhất định. Nhu cầu về vắc-xin an toàn, hiệu quả cao là cấp thiết.
1.2. Tiềm năng của hệ thống biểu hiện thực vật
Hệ thống biểu hiện thực vật cung cấp nền tảng sản xuất protein tái tổ hợp. Cây thuốc lá là một lựa chọn lý tưởng. Hệ thống này có ưu điểm về chi phí thấp, quy mô lớn, an toàn sinh học. Thực vật không chứa mầm bệnh động vật. Nicotiana benthamiana, một loại cây thuốc lá, được sử dụng rộng rãi. Protein virus có thể được biểu hiện trong thực vật. Phương pháp này mở ra hướng mới cho sản xuất vắc-xin. Đây là một lĩnh vực của nông nghiệp phân tử.
1.3. Lợi ích của vắc xin tiểu đơn vị từ cây thuốc lá
Vắc-xin tiểu đơn vị chỉ chứa kháng nguyên đích. Chúng an toàn hơn vắc-xin sống hoặc vô hoạt. Nguy cơ gây bệnh được loại bỏ hoàn toàn. Biểu hiện kháng nguyên PRRSV trong cây thuốc lá cho phép sản xuất vắc-xin tiểu đơn vị. Vắc-xin thực vật có thể dễ dàng bảo quản. Chúng không cần chuỗi lạnh phức tạp. Điều này đặc biệt có lợi ở các vùng khó khăn. Công nghệ này có tiềm năng phát triển vắc-xin PRRSV thế hệ mới.
II. Kỹ thuật biểu hiện kháng nguyên PRRSV trong cây thuốc lá
Nghiên cứu này ứng dụng kỹ thuật di truyền thực vật để biểu hiện kháng nguyên PRRSV. Phương pháp thẩm lọc Agrobacterium tumefaciens được sử dụng. Đây là một công cụ mạnh mẽ và phổ biến. Nó cho phép đưa gen ngoại lai vào tế bào thực vật một cách hiệu quả. Việc sử dụng cây Nicotiana benthamiana làm vật chủ là then chốt. Loài cây này có khả năng biểu hiện protein cao. Quy trình chuyển gen bao gồm việc thiết kế vector, nhân dòng gen và thẩm lọc. Mỗi bước được thực hiện cẩn thận để đảm bảo hiệu quả biểu hiện. Kỹ thuật này giúp sản xuất protein tái tổ hợp nhanh chóng. Nó cung cấp vật liệu cho các thử nghiệm tiếp theo. Ưu điểm của phương pháp này là tính linh hoạt. Nó cho phép điều chỉnh các điều kiện biểu hiện để tối ưu hóa sản lượng protein.
2.1. Phương pháp thẩm lọc Agrobacterium tumefaciens
Thẩm lọc Agrobacterium tumefaciens là kỹ thuật di truyền thực vật phổ biến. Kỹ thuật này đưa gen ngoại lai vào tế bào thực vật. Agrobacterium mang vector biểu hiện chứa gen mã hóa kháng nguyên. Vi khuẩn được tiêm vào lá cây thuốc lá. Tế bào thực vật hấp thụ DNA từ Agrobacterium. Gen ngoại lai sau đó được biểu hiện tạm thời. Phương pháp này nhanh chóng, hiệu quả. Nó cho phép đánh giá biểu hiện protein trong thời gian ngắn.
2.2. Vai trò của Nicotiana benthamiana trong nghiên cứu
Nicotiana benthamiana là cây thuốc lá mô hình. Nó rất nhạy cảm với Agrobacterium. Cây này dễ dàng chấp nhận gen ngoại lai. Nicotiana benthamiana có khả năng biểu hiện protein ở mức độ cao. Tế bào của nó có cơ chế ức chế gen yếu. Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho biểu hiện protein tái tổ hợp. Cây này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu nông nghiệp phân tử. Nó trở thành lựa chọn hàng đầu cho sản xuất vắc-xin thực vật.
2.3. Quy trình chuyển gen hiệu quả vào thực vật
Quy trình chuyển gen bao gồm nhiều bước. Đầu tiên, gen kháng nguyên được nhân dòng vào vector biểu hiện thực vật. Sau đó, vector này được chuyển vào Agrobacterium tumefaciens. Chủng Agrobacterium biến đổi gen được nuôi cấy. Hỗn dịch vi khuẩn được điều chỉnh nồng độ. Hỗn dịch này được thẩm lọc vào mặt dưới lá cây thuốc lá. Sau vài ngày, protein kháng nguyên được biểu hiện. Lá cây thu hoạch để chiết tách protein.
III. Thiết kế kháng nguyên PRRSV M GP5 cho biểu hiện tối ưu
Việc lựa chọn và thiết kế gen kháng nguyên là bước quan trọng. Các gen M, GP5 và GP5ectoM của virus PRRS được chọn làm mục tiêu. Chúng là các protein vỏ và màng, đóng vai trò chính trong tương tác virus-vật chủ. Kháng nguyên này có khả năng kích hoạt phản ứng miễn dịch. Các gen được nhân dòng vào vector biểu hiện thực vật chuyên biệt. Thiết kế vector bao gồm các yếu tố điều hòa mạnh mẽ. Việc dung hợp với đoạn peptide ELP (Elastin-like polypeptide) hỗ trợ tinh sạch. Quá trình này đảm bảo protein tái tổ hợp được sản xuất với chất lượng cao. Protein chất lượng cao là yếu tố quyết định. Chúng phải giữ được cấu trúc và tính sinh miễn dịch. Điều này cực kỳ quan trọng cho ứng dụng vắc-xin.
3.1. Lựa chọn gen kháng nguyên M GP5 và GP5ectoM
Nghiên cứu tập trung vào các kháng nguyên quan trọng của PRRSV. Gen M mã hóa protein màng. Gen GP5 mã hóa glycoprotein vỏ. GP5ectoM là dạng dung hợp của GP5 đoạn ngoại bào và M. Các protein này đóng vai trò then chốt trong miễn dịch. Chúng là mục tiêu tiềm năng cho phát triển vắc-xin. Việc biểu hiện các kháng nguyên này là bước đầu. Nó giúp tạo ra phản ứng miễn dịch bảo vệ.
3.2. Xây dựng vector biểu hiện thực vật chuyên biệt
Các gen mã hóa kháng nguyên được nhân dòng. Chúng được đưa vào vector biểu hiện thực vật. Các vector này chứa các yếu tố điều hòa biểu hiện. Ví dụ, promoter mạnh mẽ (như 35S của virus khảm súp lơ). Nó giúp tăng cường mức độ biểu hiện. Các đoạn gen ELP (Elastin-like polypeptide) cũng được dung hợp. ELP hỗ trợ tinh sạch protein tái tổ hợp hiệu quả. Thiết kế vector tối ưu hóa sản lượng protein. Nó đảm bảo tính ổn định của protein.
3.3. Tầm quan trọng của protein tái tổ hợp chất lượng cao
Protein tái tổ hợp cần có chất lượng cao. Chúng phải giữ được cấu trúc không gian ba chiều. Điều này cần thiết cho tính sinh miễn dịch. Biểu hiện đúng cách đảm bảo khả năng nhận diện kháng thể. Các gen kháng nguyên được tối ưu hóa codon. Tối ưu hóa phù hợp với cây thuốc lá. Điều này cải thiện hiệu quả dịch mã. Protein được tổng hợp với số lượng lớn. Chúng duy trì hoạt tính sinh học.
IV. Tối ưu hóa và xác định protein tái tổ hợp PRRSV thực vật
Để đạt được hiệu quả biểu hiện cao nhất, các điều kiện được tối ưu hóa. Nồng độ Agrobacterium, thời gian thẩm lọc và các yếu tố môi trường được điều chỉnh. Mục tiêu là tối đa hóa sản lượng protein tái tổ hợp. Sau quá trình biểu hiện, lá cây được thu hoạch. Protein tổng số được tách chiết. Các kỹ thuật phân tích như SDS-PAGE và Western blot được sử dụng. Chúng giúp định lượng và xác nhận sự hiện diện của protein đích. Quá trình tinh sạch protein cũng được thực hiện. Nó đảm bảo độ tinh khiết cần thiết cho các thử nghiệm tiếp theo. Phân tích đặc tính sinh hóa xác nhận tính toàn vẹn và hoạt tính của protein. Đây là bước then chốt để đánh giá tiềm năng vắc-xin.
4.1. Tối ưu điều kiện biểu hiện gen tạm thời
Các điều kiện biểu hiện tạm thời được tối ưu hóa. Nồng độ Agrobacterium là yếu tố quan trọng. Thời gian thẩm lọc cũng ảnh hưởng đến hiệu quả. Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, ánh sáng được kiểm soát. Sử dụng vector hỗ trợ biểu hiện cũng được nghiên cứu. Mục tiêu là đạt được mức biểu hiện protein cao nhất. Điều này giúp tối đa hóa năng suất sản phẩm.
4.2. Định lượng và tinh sạch protein tái tổ hợp
Sau khi biểu hiện, lá cây được thu hoạch và nghiền. Protein tổng số được tách chiết. Các kỹ thuật như điện di SDS-PAGE được sử dụng để định lượng. Lai Western blot giúp xác nhận sự có mặt của protein đích. Phương pháp này sử dụng kháng thể đặc hiệu. Protein tái tổ hợp được tinh sạch bằng sắc ký hoặc phương pháp ELP. Tinh sạch đảm bảo độ tinh khiết cao. Protein tinh khiết cần cho các thử nghiệm tiếp theo.
4.3. Phân tích đặc tính sinh hóa protein sản xuất
Protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP được phân tích. Cấu trúc và hoạt tính sinh học được kiểm tra. Phân tích xác nhận tính toàn vẹn của protein. Điều này đảm bảo protein giữ được epitope kháng nguyên. Protein phải có khả năng tương tác với hệ thống miễn dịch. Dữ liệu này rất quan trọng. Nó đánh giá tiềm năng của kháng nguyên làm vắc-xin.
V. Đánh giá miễn dịch kháng nguyên PRRSV Hướng tới Vắc xin
Bước cuối cùng là đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên PRRSV được biểu hiện. Các protein GP5-ELP, GP5ectoM-ELP và M-ELP được thử nghiệm trên động vật. Mục đích là xác định khả năng của chúng trong việc kích thích phản ứng miễn dịch. Việc sản xuất kháng thể đặc hiệu là một chỉ số quan trọng. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa lớn. Nó mở ra triển vọng phát triển vắc-xin thực vật an toàn và hiệu quả chống lại PRRSV. Công nghệ này có thể thay đổi cách tiếp cận sản xuất vắc-xin. Nó góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành chăn nuôi. Nông nghiệp phân tử tiếp tục chứng tỏ tiềm năng ứng dụng rộng rãi. Nó không chỉ giới hạn trong vắc-xin mà còn nhiều sản phẩm dược phẩm khác.
5.1. Thử nghiệm tính sinh miễn dịch trên động vật
Các kháng nguyên GP5-ELP, GP5ectoM-ELP, M-ELP được đánh giá. Tính sinh miễn dịch được thử nghiệm trên động vật thí nghiệm. Động vật được tiêm kháng nguyên. Sau đó, phản ứng miễn dịch được theo dõi. Sản xuất kháng thể đặc hiệu là một chỉ số quan trọng. Thử nghiệm này xác định khả năng kích thích miễn dịch. Nó đánh giá hiệu quả bảo vệ tiềm năng.
5.2. Hứa hẹn của vắc xin thực vật chống PRRSV
Kết quả nghiên cứu mở ra triển vọng lớn. Vắc-xin thực vật có thể phòng chống PRRSV hiệu quả. Công nghệ này cung cấp giải pháp sản xuất an toàn. Vắc-xin tiểu đơn vị từ cây thuốc lá giảm thiểu rủi ro. Chi phí sản xuất dự kiến thấp. Điều này làm cho vắc-xin dễ tiếp cận hơn. Nó góp phần kiểm soát dịch bệnh PRRSV tốt hơn.
5.3. Triển vọng ứng dụng nông nghiệp phân tử rộng rãi
Nghiên cứu này là một ví dụ điển hình. Nó minh họa tiềm năng của nông nghiệp phân tử. Kỹ thuật di truyền thực vật có thể sản xuất nhiều loại dược phẩm. Vắc-xin, kháng thể, enzyme là những sản phẩm tiềm năng. Hệ thống biểu hiện thực vật là một công cụ mạnh mẽ. Nó đóng góp vào an ninh lương thực và y tế toàn cầu. Phát triển vắc-xin thực vật là hướng đi chiến lược.
Mục lục chi tiết luận án
Tải xuống file đầy đủ để xem toàn bộ nội dung
Tải đầy đủ (179 trang)Trích đoạn nội dung luận án
Tải xuống để đọc toàn bội VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ AGROBACTERIUM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2018 i ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ MINH HẰNG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN (M, GP5, GP5ectoM) CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN TRONG CÂY THUỐC LÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP THẨM LỌC NHỜ AGROBACTERIUM Chuyên ngành: Hoá sinh học Mã số: 94 20 116 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. Nguyễn Trung Nam Viện Công nghệ sinh học 2. Chu Hoàng Hà Viện Công nghệ sinh học HÀ NỘI – 2018 ii iii LỜI CẢM ƠN Luận án được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam và Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương. Với sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài thuộc nhiệm vụ nghiên cứu thường xuyên của Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.
Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của tập thể cán bộ hướng dẫn, các thầy cô giáo, các nhà khoa học, các anh chị em đồng nghiệp và quý cơ quan, phòng ban. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo, Bộ phận đào tạo sau đại học, các phòng chức năng của Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy, PGS. Chu Hoàng Hà và TS.
Nguyễn Trung Nam đã định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn GS. Lê Trần Bình, PGS. Phạm Bích Ngọc, PGS.
Đinh Duy Kháng, PGS. Tô Long Thành, TS. Nguyễn Tường Vân, ThS. Hồ Thị Thương và tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen đã luôn giúp đỡ, chia sẻ những kiến thức quý báu và tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Lâm nghiệp, Ban Lãnh đạo, cùng toàn thể cán bộ của Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để cho tôi yên tâm học tập và thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và các đồng nghiệp đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án này. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Minh Hằng iii i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. Chu Hoàng Hà, TS.
Nguyễn Trung Nam và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần kết quả còn lại của luận án chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Minh Hằng i ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU Chương 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Sơ lược tình hình dịch bệnh. Bệnh tích của PRRS.
Vaccine phòng PRRS. Vaccine sống - nhược độc. Vaccine vô hoạt. Các dạng vaccine thử nghiệm dựa vào kháng nguyên GP5 và M chống PRRSV.
Biểu hiện tạm thời kháng nguyên của PRRSV bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium. Lợi thế của phương pháp biểu hiện gen tạm thời nhờ Agrobacterium. Quá trình thẩm lọc nhờ A. Một số giải pháp tăng cường biểu hiện gen tạm thời ở thực vật.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Chủng vi khuẩn. Các vector và vật liệu thực vật, động vật. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.
Phương pháp nghiên cứu. Nhân dòng gen mã hoá protein GP5, M và GP5ectoM của virus PRRS. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện mang gen m, gp5opt và gp5ecto-m phục vụ chuyển gen. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên tái tổ hợp trong lá thuốc lá N.
Đánh giá ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện gen tạm thời đến mức độ biểu hiện protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP trong lá cây thuốc lá. Tách chiết và xác định nồng độ protein tổng số. Điện di SDS-PAGE và lai Western blot. Tinh sạch protein M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP.
Phương pháp đánh giá tính sinh miễn dịch của các kháng nguyên GP5- ELP, GP5ectoM-ELP, M-ELP trên động vật thí nghiệm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen m, gp5, gp5ecto-m và tạo chủng A. tumefaciens mang vector tương ứng.
Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên M dung hợp ELP (M- ELP). Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên GP5 dung hợp ELP (GP5-ELP). Vector chuyển gen mang gen mã hoá kháng nguyên GP5ectoM dung hợp ELP (GP5ectoM-ELP). Tối ưu các điều kiện biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M - ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP trong cây thuốc lá N.
Ảnh hưởng của vector hỗ trợ. Ảnh hưởng của nồng độ AS. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn A. Ảnh hưởng của tuổi của lá.
Ảnh hưởng của tuổi cây. So sánh mức độ biểu hiện các gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5- ELP, GP5ectoM-ELP trong điều kiện đã được tối ưu bằng lai miễn dịch. Tinh sạch kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP. Tối ưu nồng độ PEG 8000 cho quá trình tinh sạch thu nhận kháng nguyên.
Tinh sạch kháng nguyên bằng phương pháp mITC. Tính sinh miễn dịch dịch thể của các kháng nguyên tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. Đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột. Đáp ứng kháng thể IgG đặc hiệu trên lợn.
BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. Biểu hiện tạm thời gen mã hoá kháng nguyên M-ELP, GP5-ELP và GP5ectoM-ELP bằng phương pháp thẩm lọc nhờ Agrobacterium. Lựa chọn kháng nguyên trong thiết kế vector biểu hiện. Mức độ biểu hiện tạm thời các kháng nguyên tái tổ hợp.
Cấu trúc vector biểu hiện và mức độ biểu hiện gen tạm thời ở thực vật. Khả năng kích thích sản sinh kháng thể IgG đặc hiệu trên chuột. Tính sinh miễn dịch dịch thể trên lợn.120 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 130 NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN.132 TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH.133 TÀI LIỆU THAM KHẢO.I iv v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AS Acetosyringone aa Amino acid (axit amin) 2b CMV Cucumber mosaic virus (CMV) 2b protein (Protein 2b của virus khảm dưa chuột) bp Base pair (Cặp base) BSA Bovine serum albumin CaMV Cauliflower mosaic virus (Virus khảm súp lơ) Cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid ER Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất) ELISA Enzyme linked immunosorbent assay ELP Elastin-like polypeptide et al And co-workers (và các cộng sự) Fc Fragment crystallizable GFP Green fluorescent protein (Protein huỳnh quang xanh) GP5 Glycoprotein 5 GP5ecto Ectodomain of glycoprotein (Vùng ngoại bào của protein GP5) HC-Pro Helper component protease (Protein hỗ trợ) HP-PRRSV Highly pathogenic Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp thể độc lực cao) HRP Horseradish peroxidase IPMA Immunoperoxidase monolayer assay (Xét nghiệm miễn dịch đơn lớp cộng hợp enzyme peroxidase) IgG Immunoglobulin G kb Kilobase kDa Kilodalton LB Luria-Bertani (Môi trường nuôi khuẩn Luria-Bertani) v vi LV Lelystad virus M Matrix/ Membrance protein MES 2-(N- Morpholino)ethanesulfonic acid mg Milligram MLV Modified-live virus (Virus sống đã làm biến đổi = virus nhược độc) mITC Membrane-based Inverse transition cycling (Chu trình chuyển pha nghịch đảo qua màng) nptII Gene mã hoá Neomycin phosphotransferase (Gen kháng kanamycin) Nos Nopaline synthase terminator nsp Non-structural protein OD Optical density (Mật độ quang) ORF Open reading frame (Khung đọc mở) PBS Phosphate-buffered saline PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Fc Stabilizing domain - "Fragment of crystallizable chain of IgG" (Vùng hằng định của kháng thể IgG) PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus (Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn) RNA Ribonucleic acid ScFv Single chain variable fragment SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis TSP Total soluble protein (Protein tổng hợp) 35S Ter 35S Terminator (Trình tự kết thúc phiên mã) VLP Virus-like particle WT Wild type (Cây không chuyển gen) vi vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Tình hình dịch PRRS giai đoạn 2015 – 2016 ……………….1 Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu gen gp5opt, gp5ecto- m và m ……………………………………………………….2 Thành phần phản ứng ghép nối gen m, gp5opt với vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xELP ……………………….3 Thành phần phản ứng ghép nối đoạn gp5ecto với gen m và với vector pRTRA 35S-Histag-Cmyc-100xEL ……………… 47 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối các cassette gen với vector pCB301 ……………………………………………………….1 So sánh mức độ biểu hiện tạm thời gen mã hoá các kháng nguyên tái tổ hợp (M-ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP) trong lá thuốc lá N.2 Hiệu suất thu hồi và mức độ tinh sạch của các protein M- ELP, GP5-ELP, GP5ectoM-ELP …………………………….
91 DANH MỤC CÁC HÌNH vii viii Hình 1.1 Đặc điểm hình thái của virus PRRS ………………………….2 Ảnh hiển vi điện tử của các hạt Arterivirus ………………….3 Mô hình cấu trúc hạt virus PRRS và các khung đọc mở trên hệ gen PRRS ………………………………………………… 12 Hình 1.4 Đặc điểm của GP5 ………………………………….5 Cấu trúc Arterivirus ………………………………………….6 Sơ đồ mô tả sự biểu hiện gen tạm thời sử dụng các vector pEAQ bằng phương pháp thẩm lọc A.7 Thẩm lọc nhờ A.8 Sơ đồ của chu kỳ chuyển pha nghịch đảo qua màng ……….1 Chuyển gen tạm thời vào lá cây thuốc lá nhờ A. tumefaciens bằng phương pháp hút chân không ………………………….2 Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên chuột ………………….3 Sơ đồ thí nghiệm gây miễn dịch trên lợn …………………….1 Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S-m-Histag-Cmyc- 100xELP …………………………………………………….2 Sơ đồ cấu trúc cassette gen m mã hoá protein M dung hợp ELP.3 Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-m-Histag- Cmyc-100xELP ……………………………………………… 63 Hình 3.4 Phân tích sản phẩm Colony-PCR kiểm tra A. tumefaciens mang vector pCB301 35S-m-Histag-Cmyc-100xELP ……….5 Thiết kế vector tách dòng pRTRA 35S-gp5opt-Histag-Cmyc- 100xELP …………………………….6 Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5opt mã hoá protein GP5 dung hợp ELP …………………………………………………….7 Kết quả thiết kế vector chuyển gen pCB301 35S-gp5opt- Histag-Cmyc-100xELP ……………………………………… 68 Hình 3.8 Sản phẩm Colony-PCR kiểm tra A.tumefaciens mang vector pCB301 35S-gp5opt-Histag-Cmyc-100xELP ……………….9 Thiết kế vector nhân dòng pRTRA 35S-gp5ecto-m-Histag- 70 viii ix Cmyc-100xELP ……………….10 Sơ đồ cấu trúc cassette gen gp5ecto-m mã hoá protein GP5ectoM dung hợp ELP trong vector pRTRA ……………… 72 Hình 3.
Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ
Trích dẫn luận án này
Nguyễn Thị Minh Hằng (2018). Biểu hiện kháng nguyên virus PRRS trong cây thuốc lá [Luận án tiến sĩ, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam]. LuanAn.net. https://luanan.net/chan-nuoi-thu-y/nghien-cuu-bieu-hien-khang-nguyen-virus-prrs-trong-cay-thuoc-la
Câu hỏi thường gặp
Luận án "Biểu hiện kháng nguyên virus PRRS trong cây thuốc lá" nghiên cứu về vấn đề gì?
Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên virus PRRS (m gp5 gp5ectom) trong cây thuốc lá nhờ Agrobacterium.
Luận án "Biểu hiện kháng nguyên virus PRRS trong cây thuốc lá" được bảo vệ tại trường nào?
Luận án này được bảo vệ tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Năm bảo vệ: 2018.
Luận án "Biểu hiện kháng nguyên virus PRRS trong cây thuốc lá" thuộc chuyên ngành gì?
Luận án "Biểu hiện kháng nguyên virus PRRS trong cây thuốc lá" thuộc chuyên ngành Hóa sinh học. Danh mục: Chăn Nuôi - Thú Y.
Luận án "Biểu hiện kháng nguyên virus PRRS trong cây thuốc lá" có bao nhiêu trang?
Luận án "Biểu hiện kháng nguyên virus PRRS trong cây thuốc lá" có 179 trang. Bạn có thể xem trước một phần tài liệu ngay trên trang web trước khi tải về.
Cách tải luận án "Biểu hiện kháng nguyên virus PRRS trong cây thuốc lá" về máy như thế nào?
Để tải luận án về máy, bạn nhấn nút "Tải xuống ngay" trên trang này, sau đó hoàn tất thanh toán phí lưu trữ. File sẽ được tải xuống ngay sau khi thanh toán thành công. Hỗ trợ qua Zalo: 0559 297 239.