Nghiên cứu bệnh cầu trùng gà: Đặc điểm bệnh lý và chế phẩm sinh học phòng trị

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HUỲNH VĂN CHƢƠNG KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HUỲNH VĂN CHƢƠNG KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ Chuyên ngành : Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số : 62 64 01 02 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. Đinh Thị Bích Lân 2. Nguyễn Hữu Nam HÀ NỘI, 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chƣa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã đƣợc cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều đƣợc chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017 Tác giả luận án Huỳnh Văn Chƣơng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình. Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi đƣợc bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy cô PGS. Đinh Thị Bích Lân, PGS. Nguyễn Hữu Nam đã tận tình hƣớng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Bộ môn Miễn dịch học và vắc xin, Viện Công nghệ sinh học- Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Xin chân thành cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày 28 tháng 7 năm 2017 Nghiên cứu sinh Huỳnh Văn Chƣơng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix Danh mục biểu đồ xi Danh mục đồ thị xi Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2 Mục tiêu của đề tài 3 1.3 Phạm vi nghiên cứu 3 1.4 Những đóng góp mới của đề tài 3 1.5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu về bệnh cầu trùng gà 4 2.1 Căn bệnh cầu trùng 4 2.2 Đặc điểm dịch tễ 13 2.3 Sinh bệnh học 14 2.4 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của gà bị bệnh cầu trùng 15 2.5 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cầu trùng gà 16 2.6 Điều trị bệnh cầu trùng gà 18 2.7 Miễn dịch chống cầu trùng ở gà 18 2.8 Vắc xin phòng bệnh cầu trùng gà 20 2.2 Tổng quan về công nghệ ADN tái tổ hợp 21 2.1 Giới thiệu chung về công nghệ ADN tái tổ hợp 21 2.2 Đặc điểm của hệ thống vector pET, pGEM-T Easy, tạo dòng và biểu hiện gene trong E.3 Công nghệ chế tạo kháng thể lòng đỏ trứng bằng phƣơng pháp gây miễn dịch cho gà mái 24 2.1 Trọng lƣợng phân tử và tính chất lý hóa của IgY (Yolk Immunoglobulin) 24 2.2 Cấu trúc của IgY 24 2.3 Độ bền của IgY 25 2.4 Lợi thế của công nghệ sản xuất IgY 26 2.5 Tách chiết IgY từ lòng đỏ trứng gà 27 2.6 Những ứng dụng của IgY 28 PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 3.1 Địa điểm nghiên cứu 31 3.2 Thời gian nghiên cứu 31 3.3 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 31 3.1 Vật liệu nghiên cứu 31 3.2 Thiết bị và hóa chất dùng cho nghiên cứu 31 3.4 Nội dung nghiên cứu 33 3.1 Khảo sát các đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà 33 3.2 Nghiên cứu tách dòng gene mã hóa kháng nguyên, tạo plasmid mang gene kháng nguyên, biến nạp vào tế bào E.3 Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết và định lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp 33 3.4 Kiểm tra độ tinh khiết và tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp 33 3.5 Nghiên cứu sản xuất bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể phòng trị bệnh 33 3.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 3.1 Phƣơng pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và xác định bệnh tích đại thể, vi thể của gà mắc cầu trùng 34 3.2 Phƣơng pháp xác định chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng 34 3.3 Phƣơng pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh ở gà 35 3.4 Phƣơng pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 35 3.5 Nghiên cứu tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên trong vector tạo dòng và biến nạp vào tế bào vật chủ E.6 Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E trong vector pET200/D-TOPO và biểu hiện gene kháng nguyên 3-1E 39 3.7 Phƣơng pháp tách chiết tinh khiết, xác định tính đặc hiệu và định lƣợng của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 40 iv 3.8 Phƣơng pháp chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà 41 3.9 Phƣơng pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị bệnh cầu trùng của chế phẩm 42 3.10 Phƣơng pháp xử lý số liệu 43 PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 4.1 Tỷ lệ nhiễm, cƣờng độ nhiễm, triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể, vi thể ở gà mắc cầu trùng 44 4.1 Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cầu trùng gà nuôi tại huyện Phú Vang, Thừa Thiên Huế 44 4.2 Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi ở gà từ 1 đến 42 ngày tuổi 44 4.3 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng 46 4.4 Bệnh tích đại thể chủ yếu ở gà mắc bệnh cầu trùng 47 4.5 Bệnh tích vi thể chủ yếu ở một số cơ quan của gà mắc bệnh cầu trùng 50 4.2 Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng 54 4.1 Một số chỉ tiêu hồng cầu ở gà từ 1-42 ngày tuổi mắc bệnh cầu trùng 55 4.2 Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu hệ bạch cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng (35-42 ngày tuổi) 56 4.3 Kết quả nghiên cứu hàm lƣợng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu trùng (35 - 42 ngày tuổi) 58 4.3 Kết quả phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 59 4.1 Thu và tinh sạch Oocyst cầu trùng gà 59 4.2 Xác định loài cầu trùng bằng phƣơng pháp PCR 59 4.3 Kết quả tách chiết ARN tổng số 60 4.4 Kết quả thực hiện PCR 61 4.5 Tinh sạch sản phẩm PCR 62 4.4 Kết quả nghiên cứu tạo dòng và biểu hiện gene 3-1E 63 4.1 Kết quả tạo dòng gene kháng nguyên 3-1E vào vector tách dòng 63 4.2 Phân tích trình tự gene 3-1E 64 4.3 Kết quả tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên 3-1E vào vector biểu hiện pET200/D-TOPO 66 4.4 Kết quả về tinh khiết và khả năng liên kết của kháng nguyên 3-1E cùng đuôi dung hợp 6His với cột Ni2+ 68 4.5 Tối ƣu điều kiện biểu hiện của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 70 v 4.1 Kết quả sinh trƣởng của E. coli BL21 (DE3) tái tổ hợp mang gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 70 4.2 Kết quả về khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng 71 4.3 Kết quả về tỷ lệ tiếp giống tối ƣu 72 4.4 Kết quả tốc độ lắc tối ƣu lên khả năng sinh trƣởng của vi khuẩn E.

coli chủng BL21 (DE3) 73 4.5 Kết quả về môi trƣờng biểu hiện tối ƣu 74 4.6 Nồng độ tối ƣu của chất cảm ứng IPTG 74 4.7 Thời gian cảm ứng của chất cảm ứng tối ƣu 75 4.8 Nhiệt độ cảm ứng tối ƣu 76 4.9 Mật độ tế bào tối ƣu 77 4.6 Tách chiết, tinh sạch, định lƣợng và xác định tính đặc hiệu của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 78 4.1 Tách chiết, tinh sạch và định lƣợng kháng nguyên tái tổ hợp 3-1E 78 4.2 Tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp 78 4.7 Chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà 79 4.1 Xác định liều lƣợng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch cho gà 79 4.2 Nghiên cứu lựa chọn tá chất gây miễn dịch cho gà 80 4.3 Định lƣợng kháng thể IgY 81 4.4 Xác định hiệu giá kháng thể trong chế phẩm lòng đỏ 82 4.5 Đánh giá hiệu quả phòng bệnh của chế phẩm 83 4.6 Đánh giá hiệu quả điều trị của chế phẩm 86 PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 89 5.2 Kiến nghị 89 Danh mục các công trình đã công bố 91 Tài liệu tham khảo 92 Phụ lục 106 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt Bp Base pair Cặp ba zơ BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid Sợi ADN bổ sung DNA Deoxyribonucleic acid A xít Deoxyribonucleic ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzyme HI Hemagglutination inhibition Ức chế ngƣng kết hồng cầu IgY Yolk Immunoglobulin Kháng thể long đỏ trứng IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside kDa Kilo dalton Kilo dalton NC Negative control Đối chứng âm OD Optical density Mật độ quang học PBS Phosphate buffer saline Dung dịch muối đệm phốt phát PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp RIA Radioimmunoassay Phƣơng pháp miễn dịch phóng xạ RT – PCR Reverse transcription polymerase chain Phản ứng chuỗi trùng hợp reaction phiên mã ngƣợc SARS Severe acute respiratory syndrome Hội chứng viêm phổi cấp tính SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide Điện di trên gel polyacrylamide gel electrophoresis WSF Water soluble fraction Phần hòa tan trong nƣớc vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1 Tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm cầu trùng trên đàn gà tại một số xã của huyện Phú Vang 44 4.2 Tỷ lệ nhiễm cầu trùng theo lứa tuổi của gà 45 4.3 Triệu chứng lâm sàng ở gà mắc bệnh cầu trùng 46 4.4 Kết quả mổ khám gà bị mắc bệnh cầu trùng 48 4.5 Tần suất xuất hiện các giai đoạn phát triển của cầu trùng gà trên tiêu bản vi thể các cơ quan gà bệnh 50 4.6 Chỉ tiêu hồng cầu ở gà mắc bệnh cầu trùng 55 4.7 Chỉ tiêu hệ bạch cầu của gà mắc bệnh cầu trùng 57 4.8 Hàm lƣợng protein huyết thanh ở gà mắc bệnh cầu trùng 58 4.9 Tỷ lệ nhiễm các loài cầu trùng gây bệnh ở gà 60 4.10 Sinh trƣởng của chủng E.