Luận án tiến sĩ nông nghiệp nghiên cứu hệ gen phiên mã transcriptome của tôm sú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------- NGUYỄN GIANG THU NGHIÊN CỨU HỆ GEN PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTOME) CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) NHẰM SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ------- NGUYỄN GIANG THU NGHIÊN CỨU HỆ GEN PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTOME) CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON) NHẰM SÀNG LỌC CÁC CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 Người hướng dẫn khoa học: 1. Đinh Duy Kháng 2. Nguyễn Hữu Ninh HÀ NỘI - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.

Hà Nội, ngày tháng năm2018 Tác giả luận án Nguyễn Giang Thu i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thiện luận án, cho phép tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc PGS. Đinh Duy Kháng – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam và PGS. Nguyễn Hữu Ninh – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 3 đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, PGS.

Đồng Văn Quyền – Phó Viện trưởng, Trưởng phòng Vi sinh vật học phân tử, TS. Nguyễn Cường – Trưởng phòng Tin sinh học- Viện Công nghệ sinh học, cùng các anh chị em trong phòng đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Nguyễn Văn Sáng, TS.

Nguyễn Văn Hảo, TS. Đặng Tố Vân Cầm, cùng các anh chị em cán bộ - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản 2 đã cung cấp mẫu tôm cho nghiên cứu này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, Ban Đào tạo sau đại học đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án.

Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nghiên cứu sinh Nguyễn Giang Thu ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN. ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT. i DANH MỤC BẢNG. ii DANH MỤC HÌNH.

iii MỞ ĐẦU. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. TÔM SÚ VÀ TÌNH HÌNH NUÔI TÔM SÚ Ở VIỆT NAM. Giới thiệu về tôm sú.

Tình hình nuôi tôm sú trên thế giới và Việt Nam. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HỆ GEN VÀ HỆ GEN PHIÊN MÃ CỦA TÔM SÚ TRÊN THẾ GIỚI. Công trình nghiên cứu đầu tiên liên quan tới hệ gen phiên mã của tôm. Xác định các gen liên quan tới hệ miễn dịch của tôm thông qua việc phân tích hệ phiên mã.

Xác định các gen có liên quan tới khả năng sinh sản của tôm. Xác định các gen có liên quan tới giới tính của tôm sú. Nghiên cứu giải trình tự hệ gen và hệ phiên mã tôm sú ở Thái Lan. Nghiên cứu lập bản đồ gen tôm sú ở Đài Loan.

Nghiên cứu giải mã hệ gen và hệ phiên mã tôm sú ở Việt Nam. CHỈ THỊ PHÂN TỬ SNP VÀ MICROSATELLITE. Chỉ thị phân tử SNP. Chỉ thị phân tử Microsatellite.

TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG VÀ MỘT SỐ GEN DỰ ĐOÁN LIÊN QUAN Ở ĐỘNG VẬT GIÁP XÁC. Tính trạng tăng trưởng. Các nhóm gen ứng viên liên quan đến tính trạng tăng trưởng đã được công bố trong nhóm giáp xác. Các nhóm gen ứng viên trong quá trình lột xác.

Các gen phân giải và phát triển hệ cơ trong quá trình lột xác. SƠ LƯỢC CÁC PHẦN MỀM LẮP RÁP SỬ DỤNG CHO CÔNG NGHỆ GIẢI TRÌNH TỰ GEN THẾ HỆ MỚI. Phân loại các phần mềm lắp ráp. Các phần mềm lắp ráp cho hệ gen.

Các phần mềm lắp ráp cho hệ gen phiên mã. 41 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.

THỜI GIAN NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG/VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Phương pháp tách riêng rẽ các mô nghiên cứu. Tách chiết RNA tổng số từ mô tôm bằng Trizol. Tách và tinh sạch mRNA. Thiết lập thư viện cDNA.

Phương pháp tiền xử lý dữ liệu. Phương pháp lắp ráp de novo hệ gen phiên mã. Phương pháp đánh giá chất lượng lắp ráp hệ phiên mã. Phương pháp chú giải chức năng của unigene trong hệ gen phiên mã ………………………………………………………………………53 2.

Phương pháp phân tích biểu hiện hệ gen phiên mã. Xác định các SNP trong ngân hàng unigene. Xác định các microsatellite trong ngân hàng unigene. Phát hiện SNP liên quan đến tính trạng tăng trưởng.

Phương pháp định lượng Real-time PCR (qPCR). 56 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN. XÂY DỰNG BỘ CƠ SỞ DỮ LIỆU HỆ GEN PHIÊN MÃ (TRANSCRIPTOME) TÔM SÚ (PENAEUS MONODON).

Sàng lọc mẫu tôm sạch bệnh. Chuẩn bị thư viện cDNA. Giải trình tự, đánh giá và tiền xử lý dữ liệu đọc trình tự thô. Lắp ráp và chú giải chức năng hệgen phiên mã.

Xây dựng bộ cơ sở dữ liệu hệ gen phiên mã (transcriptome) tôm sú (Penaeus monodon). SÀNG LỌC CÁC GEN GIẢ ĐỊNH (UNIGENE) LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON). Sàng lọc các unigene. Phân tích sự biểu hiện khác nhau của hệ gen phiên mã tôm sú (Penaeus monodon).

SÀNG LỌC CÁC SNP LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG CỦA TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)TỪ DỮ LIỆU HỆ PHIÊN MÃ. SÀNG LỌC CÁC SNP LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH TRẠNG TĂNG TRƯỞNG TỪ NHÓM TÔM SÚ GIA HÓA TĂNG TRƯỞNG NHANH VÀ TĂNG TRƯỞNG CHẬM. 99 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 102 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ.

103 TÀI LIỆU THAM KHẢO. 123 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt 3’UTR 3’ untranslated region (trình tự không dịch mã đầu 3’) cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid (DNA bổ sung được tổng hợp từ mRNA) Contig Contiguous nucleotide sequence DNA deoxyribonucleic acid EC Enzyme commission IHHNV Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (virus gây gệnh hoại tử cơ quan tạo máu và cơ quan tạo biểu mô) MBV Monodon baculovirus (virus gây bệnh còi) Nr-NCBI Non redundant protein database-National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng khuếch đại gen) RNA Ribonucleic acid RNA-seq RNA sequencing (giải trình tự RNA) TSV Taura syndrome virus (virus gây hội chứng Taura) WSSV White spot syndrome virus (virus gây hội chứng đốm trắng) YHV Yellow head virus (virus gây bệnh đầu vàng) QC Quality score (Điểm chất lượng đánh giá trình tự) i DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Các mẫu tôm sú thu từ vùng biển khác nhau của Nghệ An-Hà Tĩnh .2: Thông tin về 10 mẫu tôm tăng trưởng nhanh và 10 mẫu tôm tăng trưởng chậm sử dụng trong phân tích hệ gen phiên mã (transcriptome) .3: Cặp mồi sử dụng cho qPCR .1: Nồng độ mRNA của các mô nghiên cứu .2: Nồng độ DNA sử dụng cho giải trình tự transcriptome bằng hệ thống Illumina MiSeq platform .3: Mô tả bộ dữ liệu sau khi giải trình tự .4: Thống kê số lượng, độ dài trình tự đọc theo từng mô.5: Thống kê kết quả lắp ráp hệ gen phiên mã tinh sạch từ các mô tôm sú Penaeus monodon .6: Thống kê kết quả chú giải chức năng tôm sú P.7: Thống kê kết quả các microsatellite trong hệ phiên mã tôm sú P.8: Thống kê miền lặp của các microsatellite trong hệ phiên mã tôm sú.9: Thống kê unigene liên quan đến tăng trưởng trong hệ gen phiên mã tôm sú .10: Sự biểu hiện của hệ phiên mã tôm sú .11: Thống kê một số SNPs được chú giải ở một số gen chính liên quan đến tính trạng tăng trưởng. 97 ii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Tôm sú thu được từ vùng biển Nghệ An, Việt Nam.2: Sản lượng tôm sú của một số nước trên thế giới vào năm 2011 (Nguyễn Bích, 2013) .3: Mô hình SNP .1: Mẫu tôm sú tự nhiên thu từ một điểm của vùng biển Nghệ An .3: Tôm sú và hình ảnh giải phẫu .1: Minh họa chất lượng của RNA trên kết quả đo bằng Bioanalyzer (https://support.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample _prep_kit_v2/input_req.2: Mẫu RNA không thể hiện được chỉ số RIN trên máy Bioanalyzer (đánh dấu màu đỏ) .3: Xác định nồng độ cDNA mô tim bằng hệ thống Bioanalyzer .4: Xác định nồng độ cDNA mô cơ và mô gan tụy bằng hệ thống Bioanalyzer .5: Xác định nồng độ cDNA mô gốc mắt bằng hệ thống Bioanalyzer 65 Hình 3.6: Kết quả đánh giá chất lượng dữ liệu trình tự đọc thô và dữ liệu trình tự đọc tinh sạch của các mô .7: Phân bố độ dài toàn bộ unigene trên hệ gen phiên mã tinh sạch .8: Thống kê kết quả chú giải BLASTX trên cơ sở dữ liệu NR-NCBI, A: Thống kê phân bố giá trị E-value, B: Thống kê phân bố độ tương đồng, C: Thống kê phân bố loài trong bộ kết quả tin cậy nhất (E-value thấp nhất).9: Thống kê thông tin chú giải chức năng trên ngân hàng Gene Ontology.10: Thống kê thông tin chú giải chức năng trên ngân hàng COG.11: Thống kê 10 con đường chuyển hóa có số lượng unigene tham gia nhiều nhất .12: Số lượng SNP ở các mô .13: Sự phân bố SNP trong các mô từ bộ cơ sở dữ liệu hệ phiên mã .14: Giao diện tìm kiếm SNP trên ngân hàng transcriptome tôm sú thu tại vùng biển Việt Nam .15: Giao diện tìm kiếm microsatellite trên ngân hàng transcriptome tôm sú thu tại vùng biển Việt Nam. Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của 125 unigene liên quan đến tính trạng tăng trưởng trên từng mô.17: Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của 20 unigene top đầu liên quan đến tính trạng tăng trưởng tìm thấy trong mô tim.18: Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của 20 unigene top đầu liên quan đến tính trạng tăng trưởng tìm thấytrong mô cơ.19: Biểu đồ nhiệt (heatmap) minh họa thể hiện mức độ biểu hiện của 20 unigenetop đầu liên quan đến tính trạng tăng trưởng tìm thấy trong mô gan tụy.