Nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính gây độc tế bào ung thư và kháng viêm của hai loài huệ biển - Luận án tiến sĩ sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Thị Viên NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ VÀ KHÁNG VIÊM CỦA HAI LOÀI HUỆ BIỂN CAPILLASTER MULTIRADIATUS (LINNAEUS, 1758) VÀ COMANTHUS DELICATA (AH CLARK, 1909) Ở VÙNG BIỂN VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Lê Thị Viên NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC, HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO UNG THƯ VÀ KHÁNG VIÊM CỦA HAI LOÀI HUỆ BIỂN CAPILLASTER MULTIRADIATUS (LINNAEUS, 1758) VÀ COMANTHUS DELICATA (AH CLARK, 1909) Ở VÙNG BIỂN VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 9.16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Nguyễn Xuân Cường Hà Nội – 2023 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của GS. Châu Văn Minh và TS. Nguyễn Xuân Cường.

Các số liệu, kết quả trong luận án là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Lê Thị Viên ii LỜI CẢM ƠN Luận án này được thực hiện tại phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, với sự hỗ trợ kinh phí đề tài nghiên cứu trọng điểm cấp Viện Hàn lâm: “Nghiên cứu khai thác các hợp chất trao đổi thứ cấp từ dược liệu San hô và Da gai ở khu vực Nam Trung Bộ (vùng biển Khánh Hòa-Bình Thuận) theo định hướng hoạt tính gây độc tế bào ung thư, kháng viêm”, mã số đề tài: TĐDLB0. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học, các đồng nghiệp, bạn bè và gia đình. Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới GS.

Châu Văn Minh và TS. Nguyễn Xuân Cường - những người Thầy người đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo và các đồng nghiệp phòng Dược liệu biển - Viện Hóa Sinh biển đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hóa sinh biển đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ tôi trong việc thử hoạt tính sinh học. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể gia đình, bạn bè và những người thân đã luôn luôn quan tâm, khích lệ, động viên tôi hoàn thành luận án này. Xin trân trọng cảm ơn! Tác giả Lê Thị Viên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN…………………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN………………………………………………………………. ii MỤC LỤC…………………………………………………………………… iii DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT……………………………….

vi DANH MỤC BẢNG………………………………………………………… vii DANH MỤC HÌNH…………………………………………………………. vii MỞ ĐẦU……………………………………………………………………. Sơ lược về các hợp chất thiên nhiên…………………….1 Phân loại các hợp chất thiên nhiên…………………….2 Hợp chất thiên nhiên biển và các thuốc bắt nguồn từ sinh vật biển…………………………………………………………………. Giới thiệu chung về ung thư……………………………………….

Ung thư và các phương pháp điều trị ung thư………………………. Mối liên hệ giữa apoptosis và ung thư………………………………. Giới thiệu về bệnh viêm…………………………………………. Cơ chế của quá trình viêm………………………………………….

Các yếu tố chính tham gia vào quá trình viêm……………………… 13 1. Ức chế sự biểu hiện iNOS và COX-2 trong nghiên cứu hoạt tính kháng viêm…………………………………………………………. Giới thiệu chung về huệ biển……………………………………… 19 1. Cấu tạo cơ thể……………………………………………………….

Sinh sản và phát triển………………………………………………. Hoạt tính sinh học các hợp chất điển hình từ các loài huệ biển……. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……. Đối tượng nghiên cứu……………………………………………… 29 2.

Loài huệ biển Capillaster multiradiatus (Linnaeus, 1758)…………. Loài huệ biển Comanthus delicata (AH Clark, 1909)………………. Phương pháp nghiên cứu…………………………………………. Quy trình xử lý, tạo cặn chiết các mẫu huệ biển……………….

Quy trình phân lập các hợp chất………………………………. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất………………. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học………………………. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư…………….

Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm………………………. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………………………. Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất…………………………………………………………………. Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài huệ biển Capillaster multiradiatus……………………………………….

Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài huệ biển Comanthus delicata. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư…………………………………………………………………… 54 3. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất từ loài Capillaster multiradiatus………………………. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất từ loài Comanthus delicata……….

Nghiên cứu cơ chế gây độc tế bào ung thư của CD7………………. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO…………………………………………………………………… 58 3. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO của các hợp chất từ loài Capillaster multiradiatus……………………. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO của các hợp chất từ loài Comanthus delicata……………………………….

Kết quả đánh giá sự ức chế biểu hiện iNOS và COX-2 của CM1…………………………………………………………………. BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU…………………… 61 4. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất………………. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài huệ biển Capillaster multiradiatus (Linnaeus, 1758)………………………….

Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ loài huệ biển Comanthus delicata (AH Clark, 1909)……………………………… 65 4. Tổng hợp và nhận xét về kết quả xác định cấu trúc hóa học các hợp chất………………………………………………………………….2 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được ……………………………………………………… 82 4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được…………. Đánh giá khả năng gây apoptosis của CD7 bằng kit Annexin V- FITC……………………………….

Đánh giá hoạt tính kháng viêm của các hợp chất phân lập được. Đánh giá khả năng ức chế sản sinh NO……………………………. Đánh giá sự ức chế biểu hiện iNOS và COX-2 của CM1…………. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………… 92 TÍNH MỚI CỦA LUẬN ÁN……………………………………………….

94 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN…… 95 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………. vi DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 13 C-NMR Carbon Magnetic Resonance Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Spectroscopy cacbon 1 H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Phổ tương tác proton-proton Correlation Spectroscopy 1 H-NMR Proton Nuclear Magnetic Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Resonance Spectroscopy proton CC Columns chromatography Sắc ký cột CD Circular dichroism Phổ lưỡng sắc tròn Spectroscopy COX-2 Cyclooxygenase-2 Cyclooxygenase-2 CTHH Cấu trúc hóa học CTPT Công thức phân tử DEPT Distortionless Enhancement by Phổ DEPT Polarisation Transfer DMSO Dimethylsulfoside Dimethylsulfoside FBS Fetal bovine serum Huyết thanh bò GĐTB Gây độc tế bào Hep-G2 Human hepatocellular Tế bào ung thư biểu mô gan ở carcinoma cell người HL-60 Human promyelocytic Tế bào ung thư máu ở người leukemia cell HMBC Heteronuclear Multiple Bond Phổ tương tác dị hạt nhân qua Connectivity nhiều liên kết HPLC High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu năng cao Chromatography HR-TOF-MS High Resolution Time of-Flight Phổ khối phân giải cao thời gian Mass Spectrometer bay HSQC Heteronuclear Single-Quantum Phổ tương tác dị hạt nhân qua vii Coherence một liên kết HCTN Hợp chất tự nhiên HT SH Hoạt tính sinh học IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế tối thiểu 50% IL Interleukin Interleukin INOS Inducible Nitric-Oxide Inducible Nitric-Oxide Synthase Synthase IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại KB Human epidemic carcinoma Tế bào ung thư biểu mô ở người LC-MS Liquid chromatography – mass Sắc kí lỏng - khối phổ spectrometry LnCaP Lymph node Carcinoma of the Tế bào ung thư tuyến tiền liệt ở Prostate người LPS Lipopolysaccharide Lipopolysacaride LU-1 Human lung carcinoma cell Tế bào ung thư phổi ở người MCF-7 Human breast carcinoma cell Tế bào ung thư vú ở người MS Mass Spectroscopy Phổ khối lượng MTT 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- 2,5-diphenyltetrazolium diphenyltetrazolium bromide bromide NF-B Nuclear Factor-kappa B Yếu tố nhân kappa B NOESY Nuclear Overhauser Phổ NOESY Enhancement Spectroscopy PI Propidium iodide Thuốc nhuộm Propidium iodide RAW264.7 Macrophage cell line Dòng tế bào đại thực bào SK-Mel-2 Human Melanoma cell Tế bào ung thư da ở người SRB Sulforhodamine B Sulforhodamine B TB UT Tế bào ung thư TCA Trichloro acetic acid Axit trichloroacetic TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng TTLT Tính toán lý thuyết viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Các dạng của NOS……………………………………………. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc TB UT của các hợp chất từ loài Capillaster multiradiatus……………….

Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc TB UT của các hợp chất từ loài Comanthus delicata……………………. Tỉ lệ các loại tế bào apoptosis dưới tác động của CD7 trên dòng tế bào SK-Mel-2…………………………………………. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO của các chất từ loài Capillaster multiradiatus………………. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế sản sinh NO của các chất từ loài Comanthus delicata…………………….

Giá trị phổ NMR của CM1……………………………………. Giá trị phổ NMR của CM2……………………………………. Giá trị phổ NMR của CM8……………………………………. Giá trị phổ NMR của CD1…………………………………….

Giá trị phổ NMR của CD2……………………………………. Giá trị phổ NMR của CD3……………………………………. Giá trị phổ NMR của CD4……………………………………. Giá trị phổ NMR của CD5…………………………………….

Giá trị phổ NMR của CD15…………………………………. Giá trị phổ NMR của CD16…………………………………. Giá trị phổ NMR của CD17…………………………………. Giá trị phổ NMR của CD18………………………………….

Giá trị phổ NMR của CD19…………………………………. 81 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1. Sơ đồ minh họa các con đường apoptosis ngoại bào và nội bào. Con đường hình thành NO từ các NOS……………………….

Cấu tạo huệ biển………………………………………………. Cấu trúc các sắc tố quinone (1-14) từ huệ biển………………. Cấu trúc các sắc tố quinone (15-25) từ huệ biển………. Cấu trúc các naphthopyrone (26-43) từ huệ biển……………… 26 Hình 1.

Cấu trúc một số bisanthrone và phenanthroperylene quinone (44-53) từ huệ biển……………………………………………. Huệ biển Capillaster multiradiatus (Linnaeus, 1758)…………. Huệ biển Comanthus delicata (AH Clark, 1909)……………… 30 Hình 2. Sơ đồ chiết phân lớp mẫu Capillaster multiradiatus………….

Sơ đồ phân tách các hợp chất từ phần Diclometan mẫu huệ biển Capillaster multiradiatus…………………………………. Sơ đồ chiết phân lớp mẫu Comanthus delicata …………. Sơ đồ phân tách các hợp chất từ phân đoạn D3, D4 mẫu huệ biển Comanthus delicata………………………………………. Sơ đồ phân tách các hợp chất từ phân đoạn D5 mẫu huệ biển Comanthus delicata…………………………………………….

Sơ đồ phân tách các hợp chất từ phân đoạn nước mẫu huệ biển Comanthus delicata……………………………………………. CTHH của các hợp chất phân lập được từ loài huệ biển Capillaster multiradiatus………………………………………. CTHH của các hợp chất phân lập được từ loài huệ biển Comanthus delicata……………………………………………. Tác động của CD7 đến apoptosis ở tế bào SK-Mel-2 thông qua Kit Annexin V-FITC………………………………….

Khả năng kích thích sản sinh caspase-3 trong tế bào SK-Mel-2 dưới tác động của CD7………………………. Ảnh hưởng của CM1 ở các nồng độ 1, 3 và 10 µM đến sự biểu 60 x hiện của protein iNOS, COX-2 trên dòng tế bào RAW264.7 được kích thích bằng LPS. CTHH và tương tác HMBC chính của CM1……………. CTHH và tương tác HMBC chính của CM2………………….

CTHH của CM8………………………………………………. CTHH và tương tác HMBC chính của CD1………………….