Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha

Phạm Thị Vân

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha tái tổ hợp của viru

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin HA, ứng dụng trong vaccine phòng bệnh cúm. Phân tích cấu trúc protein HA và tối ưu hóa kháng nguyên.

Trường ĐH

Học viện Khoa học và Công nghệ

Chuyên ngành

Sinh học

Tác giả

Luan An

Thể loại

Luận án tiến sĩ

Năm xuất bản

2021

Số trang

182

Thời gian đọc

28 phút

Lượt xem

0

Lượt tải

0

Phí lưu trữ

50 Point

Tổng quan nhanh

Chủ đề:: 1. Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin HA cúm gia cầm
Số trang:: 182 trang
Trường:: Học viện Khoa học và Công nghệ
Chuyên ngành:: Sinh học
Tác giả:: Phạm Thị Vân
Năm:: 2021

Tóm tắt nội dung luận án

I. Nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin HA cúm gia cầm

Virus cúm A H5N1 là tác nhân truyền nhiễm nguy hiểm ở gia cầm và người. Dịch bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi toàn cầu. Việc sản xuất vaccine truyền thống trên trứng gà có phôi tồn tại nhiều rủi ro. Phương pháp này đòi hỏi thời gian nuôi cấy dài và cơ sở an toàn sinh học cao. Các nhà khoa học chuyển hướng sang công nghệ protein tái tổ hợp. Nhiều nền tảng sản xuất sinh học đã được thử nghiệm. Trong đó, hệ thống biểu hiện Pichia pastoris và hệ thống biểu hiện baculovirus tế bào côn trùng là hai giải pháp quen thuộc. Tuy nhiên, việc biểu hiện trên thực vật mang lại nhiều lợi thế vượt trội. Công nghệ này có chi phí thấp, tốc độ biểu hiện nhanh và khả năng mở rộng quy mô linh hoạt. Luận án tập trung phát triển kháng nguyên hemagglutinin tái tổ hợp nhằm tạo nền tảng vaccine phòng chống dịch cúm hiệu quả.

1.1. Tác động nguy hiểm từ virus cúm A H5N1 trên gia cầm

Virus cúm A H5N1 liên tục biến đổi di truyền qua các năm. Các biến chủng mới xuất hiện tạo ra nhiều nhánh clade phức tạp. Kháng nguyên bề mặt Hemagglutinin đóng vai trò chính trong quá trình virus xâm nhập tế bào vật chủ. Protein này quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên của từng phân loài cúm. Sự trôi dạt kháng nguyên khiến các loại vaccine thương mại suy giảm hiệu lực bảo vệ. Do đó, việc nghiên cứu cấu trúc phân tử của protein này rất quan trọng. Mục tiêu chính là thiết kế các phân tử kháng nguyên mang epitope bảo tồn cao. Cấu trúc kháng nguyên tối ưu giúp kích thích hệ miễn dịch tạo kháng thể trung hòa đa dòng. Nền tảng này mở ra hướng sản xuất vaccine cúm phổ rộng cho đàn gia cầm.

1.2. So sánh hệ thống biểu hiện Pichia pastoris và baculovirus

Hệ thống biểu hiện Pichia pastoris thường được dùng để sản xuất protein số lượng lớn. Nấm men này có tốc độ phân chia tế bào nhanh và môi trường nuôi cấy rẻ tiền. Tuy vậy, nấm men thường xảy ra hiện tượng tăng đường hóa làm biến dạng cấu trúc kháng nguyên. Hệ thống biểu hiện baculovirus tế bào côn trùng mang lại hiệu quả dịch mã chuẩn xác hơn. Hệ thống này đảm bảo quá trình cuộn gập cấu trúc không gian ba chiều của protein. Dẫu vậy, chi phí vận hành môi trường tế bào côn trùng rất đắt đỏ. Thời gian nuôi cấy cũng kéo dài và khó mở rộng quy mô khẩn cấp khi có dịch bùng phát. Hệ thống biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá khắc phục toàn diện các nhược điểm này. Thực vật thực hiện sửa đổi sau dịch mã tương tự tế bào động vật nhưng có chi phí sản xuất thấp hơn nhiều.

II. Biểu hiện gen hemagglutinin HA tái tổ hợp trên thực vật

Biểu hiện gen hemagglutinin trên cây thuốc lá sử dụng công nghệ chuyển gen tạm thời qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Phương pháp này còn gọi là agroinfiltration. Quy trình cho phép thu nhận protein tái tổ hợp HA chỉ sau 5 đến 7 ngày xâm nhiễm. Cây thuốc lá Nicotiana benthamiana được lựa chọn làm sinh khối thực vật chủ đạo. Toàn bộ quá trình diễn ra nhanh chóng mà không cần tạo cây chuyển gen ổn định. Cấu trúc vector được bổ sung các trình tự tăng cường dịch mã và tín hiệu định vị nội bào. Phương pháp này giảm thiểu độc tính tế bào và hạn chế tối đa nguy cơ lây nhiễm mầm bệnh từ động vật. Đây là giải pháp sản xuất kháng nguyên sinh học an toàn, bền vững và thân thiện với môi trường.

2.1. Thiết kế vector mang biểu hiện gen hemagglutinin tái tổ hợp

Vector biểu hiện mang trình tự biểu hiện gen hemagglutinin tối ưu hóa codon cho thực vật. Trình tự gen được chọn lọc từ các chủng virus cúm A lưu hành phổ biến tại Việt Nam. Đoạn mã hóa vùng ngoại bào của protein HA được liên kết với chuỗi peptide đàn hồi ELP. Sự kết hợp này giúp tăng cường đáng kể mức độ tích lũy của kháng nguyên hemagglutinin tái tổ hợp trong mô lá. Ngoài ra, cấu trúc còn bổ sung trình tự peptide tạo oligomer hóa. Trình tự này mô phỏng dạng trimer tự nhiên của phân tử virus thật. Cấu trúc trimer giúp phơi bày tối đa các vị trí quyết định kháng nguyên trên bề mặt. Nhờ vậy, sản phẩm protein tái tổ hợp thu được có độ ổn định cấu trúc rất cao.

2.2. Kỹ thuật xâm nhập tạm thời Agroinfiltration trên cây thuốc lá

Kỹ thuật agroinfiltration được thực hiện bằng cách hút dịch vi khuẩn vào mặt dưới lá cây thuốc lá. Chủng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp được nuôi cấy đến mật độ quang học thích hợp. Sau đó, tế bào vi khuẩn được thu hoạch và pha trong dung dịch đệm xâm nhiễm chuyên dụng. Quá trình xâm nhập diễn ra đồng loạt trên toàn bộ tán lá cây thuốc lá. Tế bào thực vật tiếp nhận T-DNA và tiến hành phiên mã, dịch mã protein ngoại lai với hiệu suất cao. Sau 6 ngày xâm nhiễm, lá cây đạt mức độ tích lũy protein tái tổ hợp HA cực đại. Sinh khối lá được thu gom và bảo quản ở nhiệt độ âm sâu trước khi đưa vào các bước chiết xuất tinh sạch tiếp theo.

III. Tinh sạch kháng nguyên hemagglutinin HA và phân tích mẫu

Quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp từ dịch chiết lá cây đóng vai trò quyết định chất lượng vaccine. Nền tảng ELP cho phép áp dụng phương pháp chuyển pha nhiệt đảo nghịch ITC. Phương pháp này loại bỏ hoàn toàn các loại protein tạp chất của thực vật chủ. Sau quá trình tinh sạch, sản phẩm được kiểm tra nghiêm ngặt về độ tinh khiết và nồng độ protein. Hai phương pháp tiêu chuẩn là phân tích Western blot và ELISA được sử dụng song song. Kết quả phân tích khẳng định protein tái tổ hợp HA giữ nguyên hoạt tính sinh học và cấu trúc kháng nguyên tự nhiên. Kháng nguyên tinh sạch đạt các tiêu chuẩn an toàn sinh học để thử nghiệm tiền lâm sàng trên động vật.

3.1. Quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp qua chuyển pha nhiệt

Mô lá cây thuốc lá được nghiền nát trong dung dịch đệm chiết xuất protein ở nhiệt độ thấp. Dịch chiết sau ly tâm chứa protein hòa tan cùng chuỗi polypeptide ELP dung hợp. Khi bổ sung muối NaCl và tăng nhiệt độ lên khoảng 40 độ C, các phân tử ELP chuyển pha và kết tụ lại. Hỗn hợp được ly tâm nóng để thu gom kết tủa protein mục tiêu. Tiếp theo, cặn protein được hòa tan lại trong đệm lạnh ở 4 độ C. Quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp qua các chu kỳ nóng lạnh giúp thu được kháng nguyên có độ sạch trên 90%. Phương pháp này tiết kiệm tối đa hóa chất đắt tiền và không đòi hỏi cột sắc ký phức tạp.

3.2. Kiểm tra chất lượng bằng phân tích Western blot và ELISA

Chất lượng kháng nguyên được đánh giá chi tiết qua phân tích Western blot và ELISA. Phương pháp Western blot sử dụng kháng thể đặc hiệu để nhận diện đúng kích thước phân tử của protein HA tái tổ hợp. Các băng protein hiển thị rõ nét tại vị trí khối lượng phân tử dự kiến, không có hiện tượng phân cắt phân tử ngoại lai. Kỹ thuật ELISA gián tiếp và ELISA sandwich được dùng để định lượng chính xác nồng độ kháng nguyên. Kết quả chứng minh protein tái tổ hợp HA dung hợp ELP liên kết chọn lọc và mạnh mẽ với kháng thể chuẩn kháng virus cúm A H5N1. Hoạt tính miễn dịch của kháng nguyên từ thực vật hoàn toàn tương đương với kháng nguyên virus tự nhiên.

IV. Đánh giá kháng nguyên hemagglutinin HA sinh miễn dịch tốt

Đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên HA là bước then chốt khẳng định tiềm năng ứng dụng thực tế. Kháng nguyên tái tổ hợp thu nhận từ cây thuốc lá được phối trộn với tá dược nhũ dầu thích hợp. Hỗn hợp vaccine được tiêm thử nghiệm trên chuột nhắt trắng và đàn gà thí nghiệm. Kết quả theo dõi cho thấy kháng nguyên kích thích hệ miễn dịch sản sinh kháng thể trung hòa ở mức cao. Các chỉ tiêu sinh lý và hành vi của động vật thí nghiệm hoàn toàn bình thường sau tiêm chủng. Thử nghiệm công cường độc với chủng virus cúm A H5N1 độc lực cao khẳng định vaccine từ thực vật bảo vệ an toàn tuyệt đối cho đàn gia cầm trước nguy cơ lây nhiễm.

4.1. Đánh giá tính sinh miễn dịch của kháng nguyên HA trên động vật

Mô hình động vật thí nghiệm được chia thành các nhóm tiêm vaccine thực vật, nhóm đối chứng dương và nhóm đối chứng âm. Kháng nguyên hemagglutinin tái tổ hợp được tiêm nhắc lại sau 2 đến 3 tuần nhằm tối ưu hóa đáp ứng miễn dịch. Mẫu huyết thanh được thu thập định kỳ sau mỗi mũi tiêm để đo lường lượng kháng thể IgG và IgM. Kết quả phân tích xác nhận tính sinh miễn dịch của kháng nguyên HA vượt trội, kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể mạnh mẽ. Hiệu giá kháng thể tăng vọt sau mũi tiêm thứ hai và duy trì nồng độ ổn định trong nhiều tuần. Động vật thí nghiệm không ghi nhận bất kỳ phản ứng phụ bất lợi nào tại vị trí tiêm.

4.2. Kiểm chứng qua phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu HI

Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu HI là tiêu chuẩn vàng để đo lường hiệu lực vaccine cúm. Kháng thể trong huyết thanh gà được tiêm vaccine có khả năng ngăn cản hoàn toàn sự ngưng kết hồng cầu gà của virus cúm A H5N1. Hiệu giá HI đạt mức bảo hộ chuẩn theo khuyến cáo quốc tế của Tổ chức Thú y Thế giới. Khi tiến hành công cường độc bằng chủng virus cúm phân lập ngoài thực địa, nhóm gà tiêm kháng nguyên tái tổ hợp đạt tỷ lệ sống sót 100%. Toàn bộ cá thể không biểu hiện triệu chứng lâm sàng và giảm thiểu sự đào thải mầm bệnh ra môi trường. Kết quả chứng minh triển vọng to lớn của công nghệ vaccine cúm sản xuất từ thực vật tại Việt Nam.

05/07/2026

Mục lục chi tiết luận án

LỜI CẢM ƠN

LỜI CAM ĐOAN

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU

1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Phân loại và đặc tính của virus cúm A/H5N1

1.2. Cấu trúc, chức năng hệ gen của virus cúm A

1.3. Cấu trúc, chức năng của protein hemagglutinin

1.4. Biến đổi thành phần hemagglutinin tạo nên các clade của virus A/H5N1

1.5. Bệnh cúm gia cầm

1.5.1. Lịch sử và tình hình dịch cúm A/H5N1 trên thế giới

1.5.2. Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam

1.6. Vaccine phòng bệnh cúm cho gia cầm

1.6.1. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm trên thế giới

1.6.2. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam

1.7. Nghiên cứu vaccine cúm phổ rộng

1.7.1. Nghiên cứu vaccine từ thực vật

1.7.2. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA ELP hoá

1.7.3. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA oligomer hoá

1.8. Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp tạm thời ở thực vật thông qua Agrobacterium (agroinfiltration)

1.8.1. Ứng dụng agroinfiltration trong nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học trên thế giới

1.8.2. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học thông qua agroinfiltration ở Việt Nam

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguồn vật liệu thực vật

2.2. Chủng vi sinh vật, plasmid, trình tự gen

2.3. Các cặp mồi sử dụng

2.4. Nguồn vật liệu động vật

2.5. Môi trường và đệm

2.6. Phương pháp

2.6.1. Phương pháp lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1

2.6.2. Phương pháp sử dụng trong thiết kế cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá

2.6.3. Phương pháp tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp

2.6.4. Phương pháp đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm

3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1

3.1.1. Thu thập và phân loại trình tự HA theo từng năm

3.1.2. Phân tích đổi mã gen và tổ hợp nhân tạo chuỗi gen mã hóa kháng nguyên HA của chủng virus cúm A/H5N1 trên cơ sở những trình tự đã biến đổi

3.1.3. Thiết kế trình tự HA COBRA đại diện các chủng virus cúm A/H5N1 quan tâm

3.1.4. Chuyển đổi các trình tự amino acid của kháng nguyên HACOBRA1 và HACOBRA2 thành các trình tự nucleotide

3.1.5. Phân tích và so sánh trình tự của các protein HA lựa chọn trong nghiên cứu

3.2. Thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá

3.2.1. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA trimer

3.2.2. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP

3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer TP

3.2.4. Lựa chọn điều kiện thích hợp cho sự biểu hiện kháng nguyên HA trên cây thuốc lá

3.2.5. Đánh giá sự biểu hiện các kháng nguyên HA tái tổ hợp trong dịch chiết thô thuốc lá

3.2.6. Đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA trong dịch chiết thô lá thuốc lá

3.3. Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp

3.3.1. Tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP từ cây thuốc lá bằng mITC

3.3.2. Tinh sạch kháng nguyên HA trimer và oligomer TP bằng IMAC

3.3.3. Trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA sau tinh sạch

3.4. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm

3.4.1. Miễn dịch trên chuột thí nghiệm

3.4.2. Miễn dịch trên gà thí nghiệm

3.5. Lựa chọn gen HA là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam

3.6. HA trimer dung hợp ELP làm tăng cường sự biểu hiện protein trong thực vật, đơn giản hoá trong tinh sạch nhưng không làm tăng cường hoạt tính sinh học của HA trimer

3.7. HA COBRA đã kích thích tạo ra kháng thể trung hoà phổ rộng trên động vật thí nghiệm

3.8. HA oligomer có hoạt tính sinh miễn dịch cao trên động vật

3.9. Dịch chiết thô thuốc lá chứa kháng nguyên HA oligomer TP có thể sử dụng làm ứng viên vaccine phòng bệnh cúm A trên động vật

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Xem trước tài liệu

Tải đầy đủ để xem toàn bộ nội dung

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha tái tổ hợp của virus cúm a h5n1 bằng phương pháp biểu hiện tạm thời trên cây thuốc lá và đánh giá khả năng sinh miễn dịch

Tải xuống file đầy đủ để xem toàn bộ nội dung

Tải đầy đủ (182 trang)

Trích đoạn nội dung luận án

Tải xuống để đọc toàn bộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Vân NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN HEMAGGLUTININ (HA) TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRÊN CÂY THUỐC LÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH MIỄN DỊCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2021 luan an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- Phạm Thị Vân NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN HEMAGGLUTININ (HA) TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 BẰNG PHƯƠNG PHÁP BIỂU HIỆN TẠM THỜI TRÊN CÂY THUỐC LÁ VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH MIỄN DỊCH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. Lê Thanh Hoà Hà Nội – 2021 luan an i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô giáo, TS. Vũ Huyền Trang và GS. Lê Thanh Hoà đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi thực hiện và hoàn thành luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. Chu Hoàng Hà, PGS. Phạm Bích Ngọc, Ths. Hồ Thị Thương, ThS.

Nguyễn Thu Giang, KTV. Trần Thị Loan cùng tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật, phòng công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện làm việc, hỗ trợ kinh phí, nhiệt tình giúp đỡ và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. Udo Conrad, TS.

Phan Trọng Hoàng, Viện nghiên cứu di truyền và cây trồng thực vật (IPK) CHLB Đức đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tại Viện IPK cũng như trong thời gian tôi học tập tại Việt Nam. Tôi xin cảm ơn sâu sắc tới TS. Trần Xuân Hạnh Công ty CP thuốc thú y Ttrung ương NAVETCO đã giúp đỡ tôi thực hiện thành công các thí nghiệm công cường độc trên gà. Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam với đề tài Nghị định thư mã số NĐT.15 và Bộ giáo dục và nghiên cứu CHLB Đức với đề tài “Plantfluvac” mã số 031A283 đã hỗ trợ kinh phí cho tôi thực hiện các nghiên cứu trong luận án này.

Tôi xin cũng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bộ phận Đào tạo, các phòng chức năng và Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và bảo vệ luận án. Cuối cùng, tôi xin dành lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Phạm Thị Vân luan an ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi, các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Nghiên cứu sinh Phạm Thị Vân luan an iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.

i LỜI CAM ĐOAN. ii MỤC LỤC. iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT. vi DANH MỤC CÁC BẢNG.

vii DANH MỤC CÁC HÌNH. viii MỞ ĐẦU. Tính cấp thiết của luận án. Mục tiêu nghiên cứu của luận án.

Các nội dung nghiên cứu chính của luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU. Phân loại và đặc tính của virus cúm A/H5N1. Cấu trúc, chức năng hệ gen của virus cúm A.

Cấu trúc, chức năng của protein hemagglutinin. Biến đổi thành phần hemagglutinin tạo nên các clade của virus A/H5N1. Bệnh cúm gia cầm. Lịch sử và tình hình dịch cúm A/H5N1 trên thế giới.

Tình hình bệnh cúm A/H5N1 ở Việt Nam. Vaccine phòng bệnh cúm cho gia cầm. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm trên thế giới. Vaccine phòng bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam.

Nghiên cứu vaccine cúm phổ rộng. Nghiên cứu vaccine từ thực vật. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA ELP hoá. Nghiên cứu vaccine dựa vào HA oligomer hoá.

Hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp tạm thời ở thực vật thông qua Agrobacterium (agroinfiltration). Ứng dụng agroinfiltration trong nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học trên thế giới. Tình hình nghiên cứu và sản xuất protein có hoạt tính sinh học thông qua agroinfiltration ở Việt Nam. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.

Nguồn vật liệu thực vật. 44 luan an iv 2. Chủng vi sinh vật, plasmid, trình tự gen. Các cặp mồi sử dụng.

Nguồn vật liệu động vật. Môi trường và đệm. Phương pháp. Phương pháp lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1.

Phương pháp sử dụng trong thiết kế cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá. Phương pháp tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp. Phương pháp đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.

Lựa chọn gen mã hoá kháng nguyên HA của các chủng virus cúm A/H5N1…. Thu thập và phân loại trình tự HA theo từng năm. Phân tích đổi mã gen và tổng hợp nhân tạo chuỗi gen mã hóa kháng nguyên HA của chủng virus cúm A/H5N1 trên cơ sở những trình tự đã biến đổi. Thiết kế trình tự HA COBRA đại diện các chủng virus cúm A/H5N1 quan tâm.

Chuyển đổi các trình tự amino acid của kháng nguyên HACOBRA1 và HACOBRA2 thành các trình tự nucleotide. Phân tích và so sánh trình tự của các protein HA lựa chọn trong nghiên cứu…. Thiết kế các cấu trúc vector biểu hiện ở thực vật mang gen mã hoá kháng nguyên HA và đánh giá sự biểu hiện tạm thời kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 trên cây thuốc lá. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA trimer.

Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer ELP. Thiết kế vector biểu hiện kháng nguyên HA oligomer TP. Lựa chọn điều kiện thích hợp cho sự biểu hiện kháng nguyên HA trên cây thuốc lá. Đánh giá sự biểu hiện các kháng nguyên HA tái tổ hợp trong dịch chiết thô thuốc lá.

Đánh giá hoạt tính ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên HA trong dịch chiết thô lá thuốc lá. Tinh sạch, đánh giá trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA tái tổ hợp. Tinh sạch kháng nguyên HA oligomer ELP từ cây thuốc lá bằng mITC. Tinh sạch kháng nguyên HA trimer và oligomer TP bằng IMAC.

Trạng thái oligomer hoá và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các kháng nguyên HA sau tinh sạch. Đánh giá khả năng gây đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên HA tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm. Miễn dịch trên chuột thí nghiệm. Miễn dịch trên gà thí nghiệm.

Lựa chọn gen HA là một yếu tố quan trọng trong nghiên cứu phát triển vaccine phòng bệnh cúm gia cầm A/H5N1 tại Việt Nam. HA trimer dung hợp ELP làm tăng cường sự biểu hiện protein trong thực vật, đơn giản hoá trong tinh sạch nhưng không làm tăng cường hoạt tính sinh học của HA trimer. HA COBRA đã kích thích tạo ra kháng thể trung hoà phổ rộng trên động vật thí nghiệm. HA oligomer có hoạt tính sinh miễn dịch cao trên động vật.

Dịch chiết thô thuốc lá chứa kháng nguyên HA oligomer TP có thể sử dụng làm ứng viên vaccine phòng bệnh cúm A trên động vật. 129 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 131 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN. 132 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ.

133 TÀI LIỆU THAM KHẢO. P1 luan an vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT bp base pair BS3 bis [sulfosuccinimidyl] suberate DNA deoxyribonucleic acid dNTP deoxyribonucleotide triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA ethylene diamine tetra-acetate acid ELISA enzyme-linked immunosorbent assay ELP elastin-like polypeptides EtBr ethidium bromide FAO The Food and Agriculture Organization HA Hemagglutinin HI hemagglutinin inhibition IMAC Immobilized metal ion chromatography kb kilobase kDa kilodalton LB Luria and Bertani mITC membrane-based inverse transition cycling OD optical density OIE The World Organisation for Animal Health PCR polymerase chain reaction SDS sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SEC size exclusion chromatography TAE tris acetate EDTA Taq DNA polymerase Thermus aquaticus DNA polymerase v/p vòng/phút WHO World Health Organization luan an vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Các gốc amino acid ở các vị trí điểm cắt protease, vị trí bám dính thụ thể, vị trí liên kết thụ thể, vị trí epitope và một vị trí glycosyl hoá bị biến đổi của các H5 từ một số chủng virus A/H5N1 khác nhau.

Danh sách các chủng virus cúm A/H5N1 phát triển vaccine. Các protein có hoạt tính sinh học, kháng thể và vaccine được sản xuất từ thực vật đang trong thử nghiệm lâm sàng hoặc có mặt trên thị trường. Danh sách mồi sử dụng trong nghiên cứu. Số lượng trình tự gen HA của các chủng virus cúm A/H5N1 gây bệnh trên gia cầm ở Việt Nam.

Các vị trí sai khác khi so sánh các trình tự protein HACOBRA clade 1. Các vị trí sai khác khi so sánh các trình tự protein HACOBRA clade 2. Danh sách các cấu trúc vector thiết kế chứa HA tự nhiên và nhân tạo. Hiệu suất thu hồi các kháng nguyên HA oligomer ELP.

Bảng tổng hợp kết quả thiết kế, biểu hiện và đánh giá hoạt tính của các kháng nguyên HA tái tổ hợp. Trình tự amino acid tại các vị trí phân cắt protein, liên kết thụ thể epitope kháng nguyên và vị trí glycosyl của các protein HA. 124 luan an viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Sơ đồ cấu trúc của virus cúm A [8].

Mô hình cấu trúc hemagglutinin xuyên lớp màng bao lipid kép. Dòng thời gian xuất hiện các clade của A/H5N1 dựa vào trình tự của gen HA ở Việt Nam [1]. Bản đồ các ổ dịch cúm A/H5N1 xảy ra ở các năm 2006 đến 2014 dựa vào số liệu được báo cáo trên OIE .

Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ

Trích dẫn luận án này

Phạm Thị Vân (2021). Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha [Luận án tiến sĩ, Học viện Khoa học và Công nghệ]. LuanAn.net. https://luanan.net/y-hoc/h5n1-bang-phuong-phap-bieu-hien-tam-thoi-tren-cay-thuoc-la-va-danh-gia-kha-nang

Câu hỏi thường gặp

Luận án "Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha" nghiên cứu về vấn đề gì?

Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin HA, ứng dụng trong vaccine phòng bệnh cúm. Phân tích cấu trúc protein HA và tối ưu hóa kháng nguyên.

Luận án "Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha" được bảo vệ tại trường nào?

Luận án này được bảo vệ tại Học viện Khoa học và Công nghệ. Năm bảo vệ: 2021.

Luận án "Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha" thuộc chuyên ngành gì?

Luận án "Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha" thuộc chuyên ngành Sinh học. Danh mục: Y Học.

Luận án "Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha" có bao nhiêu trang?

Luận án "Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha" có 182 trang. Bạn có thể xem trước một phần tài liệu ngay trên trang web trước khi tải về.

Cách tải luận án "Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên hemagglutinin ha" về máy như thế nào?

Để tải luận án về máy, bạn nhấn nút "Tải xuống ngay" trên trang này, sau đó hoàn tất thanh toán phí lưu trữ. File sẽ được tải xuống ngay sau khi thanh toán thành công. Hỗ trợ qua Zalo: 0559 297 239.

Luận án liên quan

Chia sẻ tài liệu: Facebook Twitter