Luận án: Vắc xin bất hoạt EV71 ngừa tay chân miệng in vivo - Nguyễn Thị Yến Nhi

_ ĐẠI HỌC QUOC GIA TP. HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYEN THỊ YEN NHI LUẬN AN TIEN SĨ SINH HOC Thành Phố Hồ Chí Minh — Năm 2023 _ ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM l TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYEN THỊ YEN NHI TẠO VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH VẮC XIN BÁT HOẠT PHÒNG NGỪA BỆNH TAY CHAN MIỆNG DO EV71 TREN MÔ HÌNH DONG VAT THU NGHIỆM INVIVO Nganh: Vi sinh vat hoc Mã số ngành: 62420107 Phản biện 1: PGS. Trần Cát Đông Phản biện 2: PSG.

Hồ Đặng Trung Nghĩa Phản biện 3: TS. Trần Tan Thanh Phản biện độc lap 1: PGS. Phạm Quang Thái Phản biện độc lập 2: TS. Trần Tan Thanh NGƯỜI HƯỚNG DAN KHOA HỌC: PSG.

Cao Thị Bảo Vân Thành Phó Hồ Chí Minh — Năm 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận án tiến sĩ ngành Vi sinh vật học, với đề tài “Tạo và đánh giá hoạt tính của vac xin bất hoạt phòng ngừa bệnh tay chân miệng do EV71 trên mô hình động vật thử nghiệm in vivo” là công trình khoa hoc do Tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS. Cao Thị Bảo Vân Những kết quả nghiên cứu của luận án hoàn toàn trung thực, chính xác và không trùng lap với các công trình đã công bô trong và ngoai nước. Nghiên cứu sinh (Ký tên, ghi họ tên) LỜI CẢM ƠN Em xin gời lời cảm ơn tới PGS. Cao Thị Bảo Vân với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến CÔ đã tận tâm hướng dẫn, đào tạo cho em trong suốt thời gian công tác tại Viện Pasteur TP.

HCM cũng như thời gian thực hiện luận án. Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành tới: Tập thể cán bộ nghiên cứu, kỹ thuật viên phòng Sinh học Phân tử, Khoa Vi Sinh Miễn Dịch, Viện Pasteur TP. HCM đã hỗ trợ và đồng hành cùng tôi trong nghiên cứu. Em xin trân trọng cảm ơn PGS.

Phan Thị Phượng Trang (giảng viên Bộ môn Vi sinh), PGS. Đặng Thị Phương Thảo, cô Trần Thị Phượng Giang (phòng Đào tạo Sau Đại học), Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TP. HCM đã hỗ trợ và tạo điều kiện cho em hoàn thành khoá học. Cuối cùng tôi xin gởi lời cảm ơn đến gia đình thân thương của tôi, những người luôn bên cạnh yêu thương, động viên, hỗ trợ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu cũng như trong tat cả hành trình mà tôi di qua.

Xin trân trọng cảm on! ii MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC TỪ VIET TÁẮTT. 2-2 ©<©2#£Es#£Ess£Ess£Essezssezssesssezssre vii DANH MỤC CAC BANG TRONG LUẬN AN .---° se ©cse©eseesseessevssecssee x DANH MỤC CAC HINH TRONG LUẬN ÁN.---s«-cs<©vssecvseervssersssrrssee xi 1. Cấu trúc hạt Vi rút. Cấu trúc bộ #€ne.

Quá trình lây nhiễm của vi rút EV71 trên tế bào chủ. Quá trình tổng hop protein Vi rÚt. Sao chép bộ Gene VI Ut .- -- - - - %+s++s k1 91 93191 91 91191 1g ng nàn rệt 10 1. Giải phóng vi rút khỏi tế bào.

Nhóm gene EV71 (ðenOðTOU)). Sự lây lan và tính sinh bệnh học của EV71. Các cơ chế miễn dịch đối với sự xâm nhiễm của E;V71. Dịch tễ học phân tử của EV71.

«<< 5s se+ssSxse+etteEtserkeesserserseerserseoksee 18 L. Trén thé on ẽẽ 334. Dịch té học bệnh ở Việt Nam. - - + St SE 2191119151 EEEEEEEEEESESESErkrkrrrrrree 20 1.

Tình hình nghiên cứu sản xuất vac xin EV71. Vac xin toàn phần bất hoạt. Vac xin vi rút sống giảm độc lực. Vắc xin VLP (virus-like partiCÌ€).- -- 5-55 52SEEE2EEE SE EEE1211211 11.

Vac xin tái tỔ hỢp. Vac xin peptide tổng hợp.-------- + ©2++2+++2+++EE++EE+2EE+SEEESEEEEErEEkrrrkrrrrrrrrres 26 1. Công nghệ sản xuất vac xin toàn phan bất hoat .---sc 2 -scs<ssessecssesses 28 1. Chọn chủng Ứng CỬ.- G5 1v TH TH nh HH HT HH nh nghệ 28 11 1.

Sản xuất kháng nguyên E'V71. Dòng tế bào. Giá thể nuôi cấyy.------¿- 2-52 SE+SE9EE9EE9EE2E12E1211211211211217111711111 11111. Tinh chế kháng nguyên .-¿-22- 22 +¿+E++2EE2EE2EEEEEEEEEEEEEEEErerkrerkrrree 32 1.

Tá chất nhôm với vac xin EV71 toàn phan bat hoạt. Đánh giá hiệu qua bảo vệ của VAC XỈn.e-s-sc se csessessevssesserserssersersssssee 35 2. CHƯƠNG2: VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. Thiết bị - đụng CỤ:.

St St kEEkEEEkE 1111511 11111111111111111111111 1111111111. ng TH HH 39 "P0 00. CAc CHUNG Vi Ut na. TẾ DA cocccccscssesssessesssessecsssssecsesssessessusssessussuessecsustsecsessuessessesssetsessusssessessueesetaes 39 2.

Động vật thí nghiỆm.- G56 S2 E311 1311133011 11 1 10v HH ng 40 Os OO NY 0U. Hóa chất va môi truONg. Hóa chất dùng cho tách chiết RNA và khuếch đại gen VP1. Hóa chất điện đi DNA.

Hóa chất cho sắc ký lọc gel. Hóa chất điện di và lai protein. Hóa chất định lượng protein bang phương pháp Bradford. Hóa chat cho phản ứng ELISA xác định kháng thé IgG kháng EV71.

Hóa chat cho phản ứng ELISA khảo sát phân lớp kháng thé IgG1 và IgG2a Khang EV71 ooo. Hóa chat tiêm chuột và gây mê .--- 22 +¿+2+++x+2Ex2EE2EEerxrrrxerrreee 42 2. Hóa chất nuôi cấy tế bào, nuôi cấy vi rút. Phương pháp nghiÊn CUU.

Chọn chủng ứng cử cho vắc xin bằng phân tích xu hướng tiến hoá và so sánh 0á. Các phương pháp nuôi cấy tẾ bào. Xác định số lượng tế bào bang buồng đếm hồng cầu. Nuôi cấy tế bào trên hệ thống lắC.

Phương pháp nuôi cấy vi rút EV 71 .------¿-©++2+++2+++2x++Ex++rx+erxterkeerkesrxrsrxee 45 2. Phương pháp xác định hiệu giá vi rút (TCTIDso). Phương pháp plaque assay va thu nhận plaque. Phương pháp RT-PCR khuếch đại trình tự gen VPI.

Phương pháp giải trình tự SanØ€T.-- 6 3 vn kg Hệ, 49 2. Phương pháp tinh chế và đánh giá chất lượng kháng nguyên. Phương pháp cô đặc kháng nguyÊn. Phương pháp sắc ký lọc gel.----- ¿5£ +E£EE£EE£EEEEEEEEEEEEEEEEkEEkrrkrrrrex 50 2.

Định lượng protein bằng phương pháp đo Brafford. Phương pháp điện di SDS-PAGE. Xác định thành phần EV71 bang phương pháp Western Blot. Phương pháp bat hoạt kháng nguyên .----- 2 2£ ++2++cx+cxz+zevrxersee 58 2.

Phương pháp đánh giá tinh sinh miễn dich và hiệu quả bảo vệ. Gay đáp ứng miễn dịch trên chuột Balb/C:. Phương pháp thu máu chuỘPt. Phương pháp ELISA xác định kháng thé IgG kháng EV7I trong huyết thanh 000111177.

Phương pháp ELISA xác định kháng thé phân lớp kháng thé IgG1, IgG2a kháng EV71 trong huyết thanh chuột. Phương pháp thử thách đánh giá hiệu quả bảo vệ của VAC xin. KET QUA VÀ BAN LUẬN. Chọn chúng bang phân tích dữ liệu dịch tễ học phân tử.

Thích nghỉ chúng trên tế bào V€rO.--ss-s°ss©sse+vsee+xseerxeesrserrssesrseesrsee 75 3. Sản xuất kháng nguyên trên hệ thống wave bioreaCfOF. Nuôi cấy tế bào Vero trên hệ thông lắc wave bioreactor với giá thê Cytodex 1. Khảo sát liều lây nhiễm tối ưu và thời gian thu hoạch Vi rút.

Khao sát thời điểm thu hoạch vi rút trên hệ thống wave bioreactOr. Tỉnh chế, bat hoạt kháng nguyên và đánh giá chất lượng kháng nguyên. Tinh chế kháng nguyên.-- -- 2-2 S2 SE‡EE£EEEEEEEE2112711211211111111 11111111 c0, 84 3. Bat hoạt kháng nguyÊn.----¿- + + ©+2+EE£EE2EEE2EE211211271121122121211 1121111 re, 87 3.

Độ tinh sạch, tính kháng nguyên va hàm lượng protein của kháng nguyên sau tinh 1. Kết quả nghiên cứu tinh sinh miễn dịch:.---s- 2s se ©ssesse=ssessessessess 92 3. Kết quả dò liều kháng nguyên ở hàm lượng thấp. Kết quả khảo sát lịch tiêm.---:- 22 St x22E£EE£EE2EEEEE2EE271E2122121 21.

Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch trên các liều kháng nguyên khác nhau và đánh giá hiệu quả của tá chất nhôm.---2- ¿2 ©++E+++EE++EE++EE++EE++EE++EE+zrxesrxeerxee 98 3. Khảo sát subtype kháng thé IgG (IgG 1/IgG2a). Kết qua khả năng trung hoa chéo của chủng vac xin ứng cử với các kiểu gen khác Maul CUA EV71 oo. Hiệu qua bảo vệ của vac xin trên chuột nhắt trang.

KET LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ .ssssssssssssssssssssssssssssssesssssssssssssssssssssssssssessssssessssssssssssssessssssessssssesessssseesssses 109 DANH MỤC CÔNG TRINH CUA TÁC GIA .------essse<ececccveessssee 110 TÀI LIEU THAM KHẢO. 2° s£s£s2€ESs#SES9£ESse©ESseE2see22sevxsetrsserrssere 111 VI DANH MUC CAC TU VIET TAT aa : Acid amin (Axit amin) APS : Ammonium Persulfate (Tên muối) bp : Base pair (Cặp bazo) CCID50 : cell culture infectious dose 50% (Liều gây nhiễm 50% tế bào) CPE : Cytopathic Effect (Biến đổi bệnh lý tế bào) DAB :3,3°-diaminobenzidine tetrahydrochloride (Tên hợp chất hóa học) DC : Dendritic Cell (Tế bào tua) DNA : Deoxyribonucleic Acid (DNA) DMEM : Dulbecco's Modified Eagle Medium (Tên một loại môi trường nuôi cấy tế bào) DMSO : Dimethyl Sulfoxide (DMSO-hợp chất hữu cơ) EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid FBS : Fetal Bovine Serum (Huyét thanh bao thai bé) EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid (Axit Etylen Diamin Tetra Acetic) ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch hap thụ liên kết với Enzyme) EV71 : Enterovirus 71 (Vi rút EV71) GMT : Geometric Mean Titer (Hiệu giá trung bình nhân) HLA : Human Leukocyte Antigen (Kháng nguyên bạch cầu người) hnRNP : Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (ribonucleoprotein nhân không đồng nhất) HRP : Horseradish Peroxidase (Peroxidaza cải ngựa) IFN : Interferon (Tén protein) IL : Interleukin (Tên protein) IRES : Internal Ribosome Entry Site (Vi tri x4m nhap cua ribosome bén trong) kb : Kilo base (Don vi do kích thước DNA) vil kDa : Kilo Dalton (Đơn vi đo kích thước protein) LD50 : Lethal Dose (Liều gây chết 50%) mRNA : Messenger RNA (RNA thong tin) MWCO : Molecular Weight Cut-off (Trọng lượng phân tử ngưỡng) NOD : Nucleotide Oligomerization Domain-like Receptors (Thụ thé tương tu phan oligo nucleotide) NLRs : Nucleotide-binding and oligomerization domain (NOD)-like receptors (Thu thé tương tu NOD) NLRP3 : NLR family pyrin domain containing 3 (Tén protein) OD : Optical Density (Mat d6 quang) OPD : O-phenylenediamine dihydrochloride (Tén hop chất hóa học) ORF : Open Reading Frame (Khung đọc mở) PBS : Phosphate Buffered Saline (Tên dung dịch) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PFU : Plaque Forming Unit (Don vi tao plaque) pNPP : p-Nitrophenyl Phosphate (Tên hợp chất hóa học) PRR : Pattern Recognition Receptor (Thu thé nhận diện kiều mau) PSGL-1 : P-Selectin Glycoprotein Ligand-1 (Tên protein) RIG-I : Retinoic acid-inducible gene I-like receptor (Thu thé tương tự gen cam tng acid retinoic) RNA : Ribonucleic acid (Axit ribonucleic) SAP : Streptavidin Alkaline Phosphatase (Tén protein) SCARB2 : Scavenger Receptor Class B Member 2 (Tên protein) SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Tên một phương pháp điện di) TBS : Tris-Buffered Saline (Tên dung dich) TCID50 : 50% Tissue Culture Infection Dose (Liều gây nhiễm 50% tế bào) TCM : Tay, chan, miéng TEMED : Tetramethylethylenediamine (Tén hop chất hóa học) Vili TIR : Toll/interleukin-1 receptor/resistance protein (Protein thu thé Toll/ Interleukin- 1) TLR : Toll-like receptor (Thu thé Toll-like) TNF : Tumor Necrosis Factor (Yếu tổ hoại tử u) TRIF : TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-f (Interferon cảm ứng thụ thể chứa TIR) UTR : Untranslated Regions (Vùng không được dịch ma) VLP : Virus-Like Particle (Hat giả virus) WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) 1X DANH MỤC CAC BANG TRONG LUẬN AN Bảng 1. Hệ thống phân loại EnterOVirus. Sơ đồ thí nghiệm xác định hiệu giá kháng thé trung hoà.

Tổng hợp các sai khác trong các vùng epitop giữa các chủng. Hiệu giá vi rút của chủng B5-203P-2013 tại các đời thích ứng khác nhau trên tế bào V€TO. Hiệu giá TCIDSO của vi rút trong các phân đoạn. Ham lượng protein tổng số của các phân đoạn thu được sau quá trình sắc [$0.

Các thí nghiệm đánh giá tính sinh miễn dịch .