Luận án Dương Ngọc Diễm: Que thử ToxA, ToxB Vibrio gây AHPND tôm nuôi

_ ĐẠI HỌC QUOC GIA TP. TRUONG DAI HOC KHOA HOC TY NHIEN DUONG NGOC DIEM NGHIEN CUU PHAT TRIEN QUE THU PHAT HIEN NHANH HAI DOC TO TOXA VA TOXB CUA VI KHUAN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GAY BENH HOAI TU GAN TUY CAP (ACUTE HEPATOPANCREATIC NECROSIS DISEASE - AHPND) TREN TOM NUOI TP. Hồ Chí Minh — Năm 2023 VIET NAM NATIONAL UNIVERSITY - HO CHI MINH UNIVERSITY OF SCIENCE DUONG NGOC DIEM RESEARCH AND DEVELOPMENT OF LATERAL FLOW IMMUNOASSAY FOR RAPID DETECTION OF TOXA AND TOXB FROM VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS CAUSING ACUTE HEPA TOPANCREATIC NECROSIS DISEASE (AHPND) IN CULTURED SHRIMP Doctoral Thesis DUONG NGOC DIEM NGHIEN CUU PHAT TRIEN QUE THU PHAT HIEN NHANH HAI DOC TO TOXA VA TOXB CUA VI KHUAN VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS GAY BENH HOAI TU GAN TUY CAP (ACUTE HEPATOPANCREATIC NECROSIS DISEASE - AHPND) TREN TOM NUÔI Nganh: CONG NGHE SINH HOC Mã số Ngành: 9420201 Phản biện 1: PGS. Nguyễn Bảo Quốc Phản biện 2: TS.

Nguyễn Thị Lệ Thủy Phản biện 3: PGS. Trần Thanh Mến Phản biện độc lập 1: miễn Phản biện độc lập 2: miễn NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. Nguyễn Thị Nguyệt Thu TP. Hồ Chí Minh — Năm 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận án tiễn sĩ ngành Công nghệ Sinh học, với dé tài “Nghiên cứu phát triển que thử phát hiện nhanh hai độc tố ToxA và ToxB của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease — AHPND) trên tôm nuôi” là công trình khoa học do Tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.

Trần Văn Hiếu và TS. Nguyễn Thị Nguyệt Thu. Những kết quả nghiên cứu của luận án hoan toàn trung thực, chính xác và không trùng lap với các công trình đã công bô trong va ngoài nước. Nghiên cứu sinh Dương Ngọc Diễm LOI CAM ON Tôi xin gửi lời biệt ơn sâu sắc đên: PGS.

Trần Văn Hiếu, Trưởng nhóm nghiên cứu Y sinh, Khoa Sinh học-Công nghệ Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Thầy đã tận tình hướng dẫn và định hướng cho tôi trong quá trình thực hiện luận án. Sự hiểu biết về khoa học cũng như kinh nghiệm của thầy chính là tiền đề giúp tôi đạt được nhiều kiến thức quý báu. Nguyễn Thị Nguyệt Thu, một người thầy-một người chị, đã dành rất nhiều tâm huyết và tạo mọi điêu kiện, động viên, giúp đỡ tôi hoàn luận án này.

Ban Giám đốc Viện Pasteur Tp.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án. Các đồng nghiệp phòng Miễn Dịch đã động viên, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn với tôi trong công việc. Quý thầy cô Khoa Sinh học-Công nghệ sinh học, Phòng Dao tạo sau đại học và các em sinh viên, học viên của phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường. Và cuối cùng xin cám ơn gia đình đã luôn sát cánh, ủng hộ, tiếp thêm sức mạnh dé tôi có thé vượt qua những khó khăn thử thách trong cuộc sống và hoàn thành luận án này.

il MỤC LỤC 0989. ii TRANG THONG TIN LUẬN AN TIENG VIET u. xi DANH MỤC CAC HINH VE.esscssessssssessessssssessessessusssessessessusssessessssusssessessesseeeess xiii DANH MỤC CAC BANG SỐ LIEUon eescssessssssessessssssessessessssssessessessnsssessesssanseseess xvii DANH MỤC CÁC CHU VIET TẮTT. TÔM VÀ NGHE NUÔI TOM Q.

Tình hình nuôi tom. Tinh hình dịch bệnh. BỆNH HOẠI TU GAN TUY CẤP. _ Tình hình nhiễm bệnh .---- 22 SE +E++EEEE+E#EEEE£EEEEEEEEEEEEEEEEEEEECEEErrkrkrrrrk 6 2.

Tac nhan gay bénh oo. — Tridu ching bénht 0 daÝÝỶÝŸŸ®. Cơ chế gây bệnh. Cau trúc vùng gen gây OC.

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH BENH. Quan sát lâm sàng. _ Phân tích mô học.--- -G 2Ă CS E221 3323111311111 11 811118111 811118 1119 k1 re 16 PT Nay o0 09. Phương pháp phát hiện kháng nguyên dựa trên kháng thê.

CHE TAO QUE THU PHAT HIỆN PROTEIN TOXA VA TOXB GAY BỆNH AHPND TREN TOM. Cấu tạo của que thte. Qui trình sản xuất que thtte. Sản xuất kháng thỂ.-2-2< St ExEE1211271211211 1111111111211 1x 22 lil 2.

Khang thể da dòng. Tinh chế khang thể.- ¿2+2 2EEt2EEt2EEE2EEEEEEE2EE211211 21222. Chuan bị phức hợp kháng thé-hat nano. G0111 HH kg và 27 2.

Kháng thé-hat vàng. _ Chọn lựa các loại màng.- - -- c1 S111 v1 9 1 nh ng ng ni 31 2. Màng nạp mẫu.-- 2-5 5%S2SE+EESEEEEEEE2EEE1212121712112121 1. Mang phản Ứng.- Gv HH TH ng HH nghiệp 32 2.

Màng que thỬ. Ăn HT HH TH TT Hà HT TH Hư 33 2. Mang dan nh. Cố định các tác nhân trên màng.---:- + 2© x+EE+EE+EEEEESEEEEEEEEEEErErrerree 36 2.

Cố định phức hợp kháng thé-hat vàng lên mang phản ứng. Cố định kháng thé bắt giữ lên màng que thử. Lắp ráp các thành phan của que thử. Cắt bản màng thành que.

Bao ion ae. Nguyên tắc hoạt động của que thử.-----¿- 2-2 z+Ex+£k+EEtEEerEzrxerxerrkerxee 38 CHUONG 3. VAT LIEU VÀ PHƯƠNG PHÁP. _ Thiết bị và dụng Cụ.

Hóa chất và môi trường. Dong vat thí nghiệm.- --- 5 s11 HH ng tư 43 1° hy na .---- 2<+Ek2E2EEEE121101121121121121111 11T cre.- LnHTHTHHT HH TH ng HT ng Hiệp 45 3.2, PHƯƠNG PHÁP. Phương pháp tạo dòng plasmid tái tổ hợp pET22b chứa gen mã hóa độc tố ToxA va ToxB của V. cvkg kiệt 47 iV 3.

| Thu nhận plasmid pVA1 chứa đoạn gen mã hóa độc tố từ V. Thu nhận gen mã hóa độc 1 48 3. Thu nhận plasmid pET22Ö. --- 6 + 2% x S19 123 kg ng re 49 3.

Tạo dòng các plasmid tái tổ hợp pET22b-toxA và pET22b-toxB. coli DHSa mang plasmid pET22b-toxA và pET22b- ¡09. Sang lọc và khang định vùng gen chèn mã hóa độc tố. Phương pháp biéu hiện độc tố tái tổ hợp ToxA và ToxB của V.

Tạo chủng biểu hiện E. coli BL21 (DE3) mang plasmid pET22b-toxA và Plasmid pET22b-tox.- - «cv TH gu Họ 34 3. Sàng lọc khuân lac dòng hOa. Biểu hiện độc tổ tái t6 Wop wecceeceeccescesessesssessesseessesseessessesssessessecssessesseesseees 54 3.

_ Phân tích sự biểu hiện độc tổ tái tô hợp bang điện di SDS-PAGE. | Khang định sự biểu hiện độc tố tái t6 hợp bang lai Western và sắc kí lỏng khối phố hai lần kỹ thuật Q Exactive Orbitrap. Phương pháp sắc ki ái lực dé tinh chế độc tố tái tổ hợp ToxA và ToxB của V. Phân tích protein sau tinh sạch bang phương pháp SDS-PAGE nhuộm bạc va phần mềm Gel AnnaÌyZer.- 2-2 2 5£ ©S£+SE£EE2EEEEEEEEEEEEEEEEEEEE1E71211271711211 2121.

Phuong pháp Bradford định lượng pDrOf€IT. Phương pháp gây miễn dịch tạo kháng thé kháng độc tố ToxA và ToxB trên "nà. Gây miễn dịch trên thỏ tạo kháng thé kháng độc tố ToxA và ToxB. Tach huyết thant.

Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của các độc tố bằng khuếch tán kép. Phương pháp ELISA đánh giá hiệu giá khang thé kháng độc tố tái tổ hợp I bý.$rraađầđầđầẳỒẳẲđẢdadaddddddẮŨŨẮŨŨOŨ. _ Phương pháp tinh chế kháng thé kháng độc tổ ToxA và ToxB. Tinh chế kháng thé bằng ammonium sulfate 50% bão hòa.

Tinh chế khang thé kháng độc tố ToxA, ToxB đặc hiệu bằng kỹ thuật sắc kí ái lực miễn dịch qua cột Sepharose 4B-ToxA va Sepharose 4B-ToxB. Kiểm tra độ tinh khiết của kháng thé khang độc tố băng phương pháp điện di SDS-PAGE nhuộm bạc và phần mềm Gel AnalyZer.-------2- 2 ©sz+cs+c5zz: 62 3. Kiếm tra tính đặc hiệu của kháng thé kháng độc tố sau tinh chế bằng phương pháp dot DÌOf. Phương pháp cộng hợp kháng thé kháng độc tô vào hạt vàng.

Cộng hợp kháng thé kháng độc tố vào hạt vàng. Xác định hiệu suất cộng hợp. Khảo sát các điều kiện cộng hợp tác động đến khả năng tương tác của hạt vàng với kháng thé kháng độc tỐ .------- 2 + E+SE+EE+EE+EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEEErrrrei 64 3. Phương pháp chế tạo que thử.

Lựa chọn mang que thử.--- 5 x2 vn HH nh HH ngư 65 3. Lựa chon màng dẫn mẫu. Lua chọn mang phan Ứng.- ---- 6 + k2 12 ng ng nưệp 66 3. Lựa chọn mang nạp TAU vee eecececececsescsesescecececscscscarscavavevsucecececacacacararavavevsves 66 3.

Lắp rap các thành phan tạo que thử hoàn chỉnh va cắt thành que. _ Xác định lượng khang thé kháng độc tố cố định lên mang que thử. _ Xác định phức hợp khang thé-hat vàng có định lên mang phan ứng. Phuong pháp phát hiện độc tố bằng que thử.---- 2 2 s¿+sz+ze+zxz+zezred 69 3.

Xác định giới hạn phát hiện và độ đặc hiệu của que thử. Độ đặc hiệu của que thử .- --- 6 25 2+ S1 v29 9 ng gi giết 69 3. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử trên mẫu tôm gây nhiễm. Theo dõi độc tổ ToxA và ToxB trong môi trường nuôi cấy VPAwpxp bằng que nmì¬.

Chuẩn bị vi khuân. Phương pháp PCR oo. Phương pháp dòng chảy bên. Phương pháp xử lý số liệu.----2- 2 + ©E£+EE£EEE2EEEEEEEEEEEEEEEEEEkrrkrrkerrrrred 72 VI CHƯƠNG 4.

KET QUA VA BAN LUẬN. TẠO DÒNG, BIEU HIỆN, TINH SẠCH ĐỘC TO TOXA VÀ TOXB CUA VIBRIO PARAHAEM(OLUYTĨC U. Tạo dong plasmid tái tổ hợp pET22b chứa gen mã hóa độc tố ToxA và ToxB CUA 22/2/7/1/12//121ã17/2/ PS. Tạo dong plasmid tái tô hợp pET22b-toxA.

Tao dong plasmid tái tổ hợp pET22b-toxB.--- 2-2 22522 z+sz+sz+se2 76 4. Biểu hiện độc tế tái tổ hợp ToxA và ToxB của V. _ Biểu hiện độc tố tái tổ hợp ToxA v. _ Biểu hiện độc tố tái tổ hợp ToxE.

SAN XUẤT KHANG THE KHANG DOC TO TOXA VA TOXB. _ Gay miễn dich trên thé tao kháng thé kháng độc tố ToxA va ToxB. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của các độc tố bằng khuếch tán kép. Theo dõi đáp ứng miễn dịch bằng phương pháp ELISA.

Xác định hiệu giá huyết thanh bằng phương pháp ELISA. _ Tinh chế kháng thỂ. Tao cột Sepharose 4B-ToxA và Sepharose 4B-ToxB. Tinh chế kháng thé đặc hiệu kháng độc tổ ToxA và ToxB bằng kỹ thuật sắc kí ái lực miễn dich qua cột Sepharose 4B-ToxA và Sepharose 4B-ToxB.

Kiểm tra độ tinh khiết của kháng thé sau tinh chế. Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thé sau tinh chế. CHE TAO QUE THU PHAT HIEN NHANH HAI DOC TO TOXA VÀ TOXB GAY BỆNH AHPND. Tạo kháng thé-hat vàng.---- 2© ¿SE SE2EEEEEEE 2112711211271 21.

_ Cộng hợp kháng thé đặc hiệu với ToxA, ToxB vào hạt vàng. Kiểm tra cộng hợp kháng thé-hat vàng tạo thành. Theo đõi độ ồn dịnh của cộng hợp kháng thé-hat vàng tạo thành. Lua chon các mảng que thử oo.

Màng que thỬ. Q Sàn TH TH TH ng nh ng cư 98 4. Màng dẫn mẫu.-- ¿252252 2EEEEEEE2EE2EE2EE21212121 2. Màng phản Ứng.

Màng nạp mẫu. Các điều kiện tác động đến cường độ tao tín hiệu của que thử. Tác động của lượng kháng thé đặc hiệu có định lên màng que thử. Tác động của lượng kháng thé-hat vàng gắn lên màng phản ứng.

Tác động của đệm chạy .- ---- c tt vH TH HH TH HH ng 108 4. Xác định giới hạn phát hiện và độ đặc hiệu của que thử. _ Độ đặc hiệu của que thỬ. — Giới hạn phát hiện của que thửỬ.

Xác định độ nhạy trên mẫu vi khuẩn nuôi cay ——. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của que thử trên mẫu tôm gây nhiễm. Xác định thời gian bảo quản que thử .