Luận án tiến sĩ: Mô hình nuôi tế bào sàng lọc cao chiết thực vật ung thư vú
Luận án tiến sĩ nghiên cứu mô hình nuôi tế bào 2D, 3D để sàng lọc cao chiết thực vật trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú VN9 CD44+/CD24-.
Sinh lý học người và động vật
Luan An
Luận án Tiến sĩ
Năm xuất bản
Số trang
204
Thời gian đọc
31 phút
Lượt xem
0
Lượt tải
0
Phí lưu trữ
50 Point
Mục lục chi tiết
Tóm tắt nội dung
I. Mô hình nuôi tế bào 2D 3D sàng lọc ung thư vú
Nghiên cứu tạo mô hình nuôi tế bào 2D và 3D đóng vai trò quan trọng trong sàng lọc thuốc chống ung thư. Mô hình này cho phép đánh giá độc tính của cao chiết thực vật trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú. Nuôi cấy tế bào ung thư theo phương pháp truyền thống 2D có nhiều hạn chế. Tế bào nuôi trên bề mặt phẳng không phản ánh đúng môi trường sinh học tự nhiên. Mô hình 3D khắc phục nhược điểm này. Tế bào được nuôi cấy thành cấu trúc khối spheroid hoặc trên scaffold nuôi cấy 3D. Phương pháp này mô phỏng tốt hơn cấu trúc khối u thực tế. Các dòng tế bào MCF-7 và MDA-MB-231 thường được sử dụng trong nghiên cứu. Hai dòng này đại diện cho các phân型 ung thư vú khác nhau. Sàng lọc cao chiết thực vật chống ung thư yêu cầu mô hình chính xác. Cell culture 2D 3D cung cấp nền tảng đánh giá hiệu quả tiền lâm sàng.
1.1. Đặc điểm tế bào ung thư vú nghiên cứu
Tế bào ung thư vú có nhiều đặc điểm sinh học đặc trưng. Dòng tế bào MCF-7 mang thụ thể estrogen dương tính. Dòng này phản ánh ung thư vú phụ thuộc hormone. Dòng tế bào MDA-MB-231 thuộc nhóm triple-negative. Nhóm này không có thụ thể estrogen, progesterone và HER2. Tế bào gốc ung thư vú có kiểu hình CD44+/CD24-. Quần thể này có khả năng tự làm mới và kháng thuốc cao. Phân lập tế bào gốc sử dụng kỹ thuật MACS với kháng thể đặc hiệu. Các marker phân tử này giúp xác định và làm giàu tế bào gốc ung thư.
1.2. Tầm quan trọng mô hình nuôi cấy 3D
Nuôi cấy tế bào ung thư 3D mang lại nhiều ưu điểm vượt trội. Mô hình này tái tạo cấu trúc không gian của khối u. Tế bào tương tác với nhau và với chất nền ngoại bào. Spheroid 3D hình thành gradient oxy và dinh dưỡng. Điều kiện này giống môi trường khối u in vivo. Scaffold nuôi cấy 3D cung cấp giá đỡ cho tế bào phát triển. Phương pháp nuôi giọt treo và đĩa tráng agarose tạo spheroid hiệu quả. Mô hình 3D cải thiện độ chính xác trong sàng lọc thuốc chống ung thư.
1.3. Ứng dụng trong sàng lọc cao chiết thực vật
Cao chiết thực vật chống ung thư cần được đánh giá trên mô hình phù hợp. Mô hình nuôi 2D và 3D cung cấp hệ thống sàng lọc đa tầng. Giai đoạn đầu sử dụng cell culture 2D để sàng lọc nhanh. Các mẫu tiềm năng được kiểm tra trên mô hình 3D. Phương pháp này tăng độ tin cậy kết quả nghiên cứu. Đánh giá IC50 cytotoxicity xác định nồng độ ức chế 50% tế bào. MTT assay đo hoạt lực tế bào qua enzyme dehydrogenase ty thể. Resazurin assay cung cấp phương pháp đo tín hiệu thay thế.
II. Phương pháp nuôi tế bào 2D sàng lọc thuốc ung thư
Nuôi tế bào lớp đơn 2D là phương pháp truyền thống trong nghiên cứu ung thư. Tế bào được cấy trên bề mặt phẳng của đĩa nuôi cấy. Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện và chi phí thấp. Nuôi cấy tế bào ung thư 2D cho phép quan sát hình thái tế bào dễ dàng. Các dòng tế bào MCF-7 và MDA-MB-231 phát triển tốt trên môi trường 2D. Tế bào bám dính vào đáy đĩa và phân chia theo lớp đơn. MTT assay được sử dụng rộng rãi để đánh giá độc tính. Phương pháp này đo hoạt động enzyme mitochondrial của tế bào sống. Kết quả phản ánh số lượng tế bào còn sống sau xử lý thuốc. Nuôi 2D phù hợp cho sàng lọc sơ bộ số lượng lớn mẫu cao chiết. Tuy nhiên, mô hình này không mô phỏng đầy đủ môi trường khối u thực tế.
2.1. Quy trình nuôi cấy tế bào 2D chuẩn
Tế bào được rã đông và nuôi trong môi trường DMEM hoặc RPMI. Môi trường bổ sung 10% FBS và kháng sinh penicillin-streptomycin. Tế bào được cấy vào flask nuôi cấy ở mật độ thích hợp. Điều kiện nuôi cấy duy trì ở 37°C với 5% CO2. Tế bào đạt 80-90% confluent sau 3-4 ngày. Quá trình cấy chuyền sử dụng trypsin-EDTA để tách tế bào. Đường cong tăng trưởng xác định thời gian nhân đôi của dòng tế bào. Phương pháp đếm tế bào sử dụng hemocytometer hoặc máy đếm tự động.
2.2. Đánh giá độc tính bằng MTT assay
MTT assay đo hoạt tính enzyme succinate dehydrogenase. Enzyme này chuyển MTT thành tinh thể formazan màu tím. Tế bào được cấy vào đĩa 96 giếng ở mật độ 5000-10000 tế bào/giếng. Sau 24 giờ, tế bào được xử lý với cao chiết ở các nồng độ khác nhau. Thời gian xử lý thường là 24, 48 hoặc 72 giờ. Dung dịch MTT được thêm vào và ủ 4 giờ. DMSO hòa tan tinh thể formazan tạo dung dịch màu. Máy đọc ELISA đo mật độ quang ở bước sóng 570nm. Giá trị IC50 cytotoxicity được tính từ đường cong liều-đáp ứng.
2.3. Phân tích chu kỳ tế bào bằng flow cytometry
Phân tích chu kỳ tế bào xác định phân bố tế bào ở các pha. Tế bào được thu hoạch và cố định bằng ethanol 70%. Nhuộm propidium iodide đánh dấu DNA trong nhân tế bào. Flow cytometry phân tích hàm lượng DNA ở từng tế bào. Kết quả cho biết tỷ lệ tế bào ở pha G0/G1, S và G2/M. Cao chiết thực vật chống ung thư có thể gây ngừng chu kỳ tế bào. Một số chất gây apoptosis tạo peak sub-G1 đặc trưng. Phương pháp này bổ sung thông tin cơ chế tác động của thuốc.
III. Kỹ thuật nuôi spheroid 3D sàng lọc cao chiết
Spheroid 3D là cấu trúc khối tế bào hình cầu nuôi cấy không giá đỡ. Phương pháp này tạo môi trường tương tự khối u thực tế hơn nuôi 2D. Tế bào tương tác với nhau qua các protein kết nối tế bào-tế bào. E-cadherin và N-cadherin đóng vai trò quan trọng trong hình thành spheroid. Cấu trúc 3D tạo gradient oxy, pH và dinh dưỡng. Lớp ngoài tiếp xúc với môi trường giàu oxy và dinh dưỡng. Lớp trong thiếu oxy tương tự vùng hoại tử của khối u. Tế bào trong spheroid 3D có kháng thuốc cao hơn nuôi 2D. Mô hình này phù hợp đánh giá cao chiết thực vật chống ung thư chính xác. Nhiều phương pháp tạo spheroid được phát triển cho sàng lọc thuốc. Phương pháp giọt treo và đĩa tráng agarose là hai kỹ thuật phổ biến.
3.1. Phương pháp nuôi giọt treo tạo spheroid
Phương pháp giọt treo (hanging drop) tạo spheroid kích thước đồng nhất. Tế bào được huyền phù ở mật độ 500-2000 tế bào/giọt. Giọt 20-30μl được đặt trên nắp đĩa Petri. Đảo ngược nắp đĩa để giọt treo ngược nhờ lực căng bề mặt. Tế bào tập trung ở đáy giọt do trọng lực. Sau 24-48 giờ, tế bào kết dính tạo spheroid compact. Phương pháp này kiểm soát tốt kích thước và số lượng tế bào. Spheroid có thể chuyển sang đĩa ultra-low attachment để nuôi tiếp.
3.2. Nuôi cấy trên đĩa tráng agarose
Đĩa tráng agarose ngăn tế bào bám dính vào đáy. Agarose 1-2% được phủ đều lên bề mặt đĩa nuôi cấy. Bề mặt không bám dính buộc tế bào kết dính với nhau. Tế bào được cấy ở mật độ 1000-5000 tế bào/cm². Lực ly tâm nhẹ giúp tế bào tập trung và kết dính. Spheroid hình thành sau 3-5 ngày nuôi cấy. Phương pháp này đơn giản và tạo được nhiều spheroid cùng lúc. Kích thước spheroid phụ thuộc vào mật độ cấy ban đầu.
3.3. Đánh giá độc tính cao chiết trên spheroid
Spheroid 3D yêu cầu phương pháp đánh giá độc tính khác nuôi 2D. MTT assay và Resazurin assay đều áp dụng được cho spheroid. Cao chiết thực vật chống ung thư được thêm vào môi trường nuôi spheroid. Thời gian xử lý thường dài hơn nuôi 2D (3-7 ngày). Thuốc cần thời gian khuếch tán vào trung tâm spheroid. Đo kích thước spheroid qua kính hiển vi cung cấp thông tin bổ sung. Giá trị IC50 trên spheroid thường cao hơn nuôi 2D. Sự khác biệt này phản ánh kháng thuốc của khối u thực tế.
IV. Scaffold nuôi cấy 3D ứng dụng sàng lọc thuốc
Scaffold nuôi cấy 3D cung cấp giá đỡ ba chiều cho tế bào phát triển. Vật liệu scaffold bao gồm polymer tự nhiên và tổng hợp. Collagen, matrigel và chitosan là các polymer tự nhiên phổ biến. Các polymer này tương thích sinh học và hỗ trợ tương tác tế bào-chất nền. Tế bào nuôi trên scaffold có hình thái và chức năng gần với in vivo. Protein kết nối như integrin, fibronectin được biểu hiện mạnh. Scaffold tạo môi trường 3D phức tạp hơn spheroid đơn thuần. Phương pháp này cho phép nghiên cứu tương tác tế bào-ECM. Tế bào gốc ung thư vú CD44+/CD24- phát triển tốt trên scaffold 3D. Mô hình này phù hợp sàng lọc thuốc chống ung thư nhắm tế bào gốc. Đánh giá hiệu quả cao chiết thực vật trên scaffold chính xác hơn nuôi 2D.
4.1. Các loại scaffold phổ biến nghiên cứu
Matrigel là scaffold từ tế bào u chuột giàu protein ECM. Thành phần chính gồm laminin, collagen IV và entactin. Matrigel hóa rắn ở 37°C tạo gel 3D. Collagen type I scaffold mô phỏng ECM tự nhiên. Chitosan là polysaccharide từ vỏ tôm có tính kháng khuẩn. Hydrogel tổng hợp như PEG, PVA kiểm soát được tính chất cơ học. Scaffold xốp tạo không gian cho tế bào di chuyển và phát triển. Kích thước lỗ xốp ảnh hưởng đến sự xâm nhập của tế bào.
4.2. Nuôi tế bào gốc ung thư trên scaffold
Tế bào gốc ung thư vú CD44+/CD24- được phân lập bằng MACS. Kỹ thuật sử dụng hạt từ tính gắn kháng thể đặc hiệu. Tế bào CD44+ được giữ lại khi qua cột từ tính. Quần thể tế bào gốc được cấy lên scaffold 3D. Mật độ cấy tối ưu là 50000-100000 tế bào/cm². Tế bào gốc duy trì kiểu hình và khả năng tự làm mới trên scaffold. Biểu hiện marker CD44, ALDH1, Sox2 được duy trì cao. Mô hình này phản ánh tính kháng thuốc của tế bào gốc ung thư.
4.3. Sàng lọc cao chiết thực vật trên scaffold
Sàng lọc thuốc chống ung thư trên scaffold 3D mang lại kết quả chính xác. Cao chiết thực vật được bổ sung vào môi trường nuôi scaffold. Nồng độ test thường từ 1-1000 μg/ml tùy mẫu. Thời gian xử lý kéo dài 5-7 ngày cho thuốc thấm đều. MTT assay hoặc Resazurin assay đánh giá hoạt lực tế bào. Phương pháp live/dead staining phân biệt tế bào sống và chết. Kính hiển vi confocal quan sát sự phân bố tế bào trong scaffold. IC50 cytotoxicity trên scaffold phản ánh hiệu quả điều trị thực tế hơn.
V. Phân tích IC50 cytotoxicity cao chiết thực vật
IC50 cytotoxicity là nồng độ cao chiết ức chế 50% hoạt lực tế bào. Thông số này đánh giá độc tính và hiệu quả tiềm năng của thuốc. Xác định IC50 yêu cầu xử lý tế bào ở nhiều nồng độ khác nhau. Thường test 6-8 nồng độ theo cấp số nhân. Đường cong liều-đáp ứng được vẽ từ dữ liệu thí nghiệm. Phần mềm GraphPad Prism hoặc Origin tính toán IC50 chính xác. Giá trị IC50 thấp cho thấy độc tính cao của cao chiết. So sánh IC50 giữa nuôi 2D và 3D đánh giá sự khác biệt. IC50 trên spheroid 3D thường cao hơn 2-10 lần nuôi 2D. Tế bào gốc ung thư có IC50 cao hơn tế bào ung thư thông thường. Cao chiết thực vật chống ung thư hiệu quả cần IC50 dưới 30 μg/ml. Phân tích này là tiêu chuẩn vàng trong sàng lọc thuốc.
5.1. Quy trình xác định IC50 chuẩn
Tế bào được cấy vào đĩa 96 giếng ở mật độ tối ưu. Sau 24 giờ bám dính, thêm cao chiết ở các nồng độ test. Nồng độ thường từ 1, 3, 10, 30, 100, 300 μg/ml. Mỗi nồng độ test ít nhất 3 giếng lặp lại. Giếng đối chứng không xử lý thuốc (100% sống). Ủ tế bào với cao chiết 48-72 giờ ở 37°C. Thực hiện MTT assay hoặc Resazurin assay đo hoạt lực. Tính phần trăm tế bào sống so với đối chứng. Vẽ đồ thị log(nồng độ) vs phần trăm sống.
5.2. Tính toán và phân tích dữ liệu IC50
Phần mềm GraphPad Prism fit đường cong liều-đáp ứng. Sử dụng phương trình log(inhibitor) vs response với slope biến thiên. Thuật toán tính IC50 tại điểm 50% trên đường cong. Khoảng tin cậy 95% đánh giá độ tin cậy của IC50. Giá trị R² > 0.95 cho thấy fit tốt. So sánh IC50 giữa các dòng tế bào bằng ANOVA. Test post-hoc Tukey xác định sự khác biệt có ý nghĩa. IC50 trên tế bào gốc cao hơn phản ánh tính kháng thuốc.
5.3. Ý nghĩa IC50 trong sàng lọc thuốc
IC50 là chỉ số quan trọng nhất trong sàng lọc cao chiết thực vật. Giá trị thấp chỉ ra tiềm năng phát triển thuốc chống ung thư. Cao chiết có IC50 < 20 μg/ml được coi là rất tiềm năng. IC50 từ 20-100 μg/ml có hoạt tính vừa phải. IC50 > 100 μg/ml thường không có giá trị điều trị. So sánh IC50 trên tế bào ung thư và tế bào bình thường. Chỉ số selectivity index đánh giá độ chọn lọc. SI = IC50(tế bào bình thường)/IC50(tế bào ung thư). SI > 3 cho thấy độc tính chọn lọc tốt với tế bào ung thư.
VI. Ứng dụng MTT assay đánh giá độc tính tế bào
MTT assay là phương pháp phổ biến nhất đánh giá hoạt lực tế bào. Nguyên lý dựa trên khả năng chuyển hóa MTT của tế bào sống. Enzyme succinate dehydrogenase trong ty thể khử MTT vàng. Sản phẩm là tinh thể formazan màu tím không tan. DMSO hòa tan tinh thể tạo dung dịch màu đo được. Mật độ quang tỷ lệ thuận với số lượng tế bào sống. Phương pháp này nhanh, đơn giản và chi phí thấp. MTT assay áp dụng cho cả nuôi 2D và spheroid 3D. Kết quả ổn định và tái lập cao khi thực hiện đúng quy trình. Phương pháp phù hợp sàng lọc số lượng lớn cao chiết thực vật. Nhiều nghiên cứu sử dụng MTT assay làm chuẩn đánh giá độc tính.
6.1. Nguyên lý và cơ chế MTT assay
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) là muối tetrazolium. Chất này màu vàng, hòa tan trong nước. Tế bào sống có enzyme dehydrogenase hoạt động trong ty thể. Enzyme này khử vòng tetrazolium của MTT. Sản phẩm formazan có màu tím đậm, không tan trong nước. Formazan tích tụ trong tế bào dưới dạng tinh thể. DMSO hoặc isopropanol hòa tan tinh thể formazan. Dung dịch màu tím có độ hấp thụ cực đại 570nm. Tế bào chết không có enzyme hoạt động nên không tạo formazan.
6.2. Quy trình thực hiện MTT assay chi tiết
Chuẩn bị dung dịch MTT 5mg/ml trong PBS, lọc vô trùng. Loại bỏ môi trường nuôi cấy khỏi giếng tế bào. Thêm 100μl môi trường mới và 10μl dung dịch MTT. Ủ đĩa ở 37°C, 5% CO2 trong 4 giờ. Quan sát tinh thể formazan tím dưới kính hiển vi. Loại bỏ môi trường cẩn thận không làm mất tinh thể. Thêm 100μl DMSO vào mỗi giếng hòa tan formazan. Lắc nhẹ đĩa 10 phút để hòa tan hoàn toàn. Đo mật độ quang ở 570nm bằng máy đọc ELISA.
6.3. Xử lý kết quả và tính toán MTT
Trừ giá trị OD của giếng trắng (không có tế bào). Tính trung bình OD của các giếng lặp lại. Phần trăm tế bào sống = (OD mẫu/OD đối chứng) × 100%. Vẽ đồ thị phần trăm sống theo nồng độ cao chiết. Sử dụng dữ liệu này tính IC50 cytotoxicity. Lưu ý MTT assay đo hoạt động enzyme, không đếm số tế bào trực tiếp. Một số hợp chất có thể gây nhiễu với MTT. Cần xác nhận kết quả bằng phương pháp khác như Resazurin.
Tải xuống file đầy đủ để xem toàn bộ nội dung
Tải đầy đủ (204 trang)Trích đoạn nội dung luận án
Tải xuống để đọc toàn bộĐẠI HOC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH TRUONG DAI HQC KHOA HOC TY NHIEN PHAN LU CHÍNH NHÂN NGHIÊN CỨU TAO MO HÌNH NUOI TE BAO 2D, 3D DUNG DE SANG LOC CAC CAO CHIET THUC VAT CO DOC TINH TREN TE BAO UNG THU VU, TE BAO GOC UNG THU VU VN9 CD44'/CD24 LUAN AN TIEN Si SINH HOC Tp. Hồ Chí Minh - Năm 2021 ĐẠI HỌC QUOC GIA THÀNH PHO HO CHÍ MINH TRUONG DAI HOC KHOA HOC TU NHIEN PHAN LU CHÍNH NHÂN NGHIEN CUU TAO MO HINH NUOI TE BAO 2D, 3D DUNG DE SANG LOC CAC CAO CHIET THUC VAT CO DOC TINH TREN TE BAO UNG THU VU, TE BAO GOC UNG THU VU VN9 CD44*/CD24- Nganh: SINH LY HOC NGUOI VA DONG VAT Mã số: 62420104 Phản biện 1: PGS. Trần Mạnh Hùng Phản biện 2: TS. Trần Thị Hải Yến Phản biện 3: TS.
Bùi Thị Kim Lý Phản biện độc lập 1: TS. Trần Thị Hải Yến Phản biện độc lập 2: TS. Bùi Thị Kim Lý Người hướng dẫn khoa học: GS. TRƯƠNG DINH KIỆT Tp.
Hồ Chí Minh - Năm 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bay trong luận án là trung thực, khách quan và chưa được công bồ bởi bat ky tác giả nào hay ở bat kỳ công trình nào khác. Tôi cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc Tác giả Phan Lữ Chính Nhân LỜI CÁM ƠN Luận án này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, Viện Tế bào gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TP.HCM và Phòng thí nghiệm David Eisenberg, Phòng thí nghiệm Sorgani, Dai học UCLA dưới sự hướng dẫn của Giáo sư Trương Đình Kiệt. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy về sự quan tâm và định hướng khoa học trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến Thầy Phan Kim Ngọc, Thầy Phạm Văn Phúc, Thầy David Eisenberg, Cô Alice Soragni đã tạo mọi điều kiện thuận lợi dé tôi có thé hoàn thành luận án nghiên cứu của mình.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các đồng nghiệp, bạn bè làm việc tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng TẾ bào gốc, Viện Tế bào gốc, Bộ môn Sinh lý học và CNSH Động vật, Khoa Sinh học, Phòng Đảo tạo sau đại học thuộc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Xin gửi món quà này đên Ba Mẹ, các Anh và Em như một lời tri ân vì đã là nguôn động lực lớn cho tôi trên suôt con đường học vân này. il MỤC LỤC 2/001 /0229. i LOT CAM ON cossssssssssssssssssssssssssusssssssssnsssssssssssecsssssssussessssssusessssssuusessssssnescesssssssesssesssseesssesees ii MUC LUC cessesssssssssssssssssssssuesssssnscsessnsecessssecesssnecsessnsssssnuecesssuecssssnecsessnsccesssuecesssseceesansceessaee iti DANH MỤC TU VIET TAT sssssssssssssssssssessssssessssssssssssssecssssvecssssvecsssssseeesssvecsssanecessaneeesses viii n0 /c8g(0e02.
xỉ DANH MUC HINH cscssssssessssssssssssssssssssecssssssssecsessssssecsssssssveceessssssecesssssssecsessssssecsessssaseeseess xii MO DAU vessssssssssssssssvsesssssvecsssssecsssssscssssvecsssssscssssssecssssvecsssssscessavecsssasecsessssesssssvecsssasscess xviii CHUONG 1. TONG QUAN assecssssssssssesssssessssecssssecssssessssecsssnecssssesssssessssscssasecssssesssseeessseeses 1 Ll. Tổng quan về ung thur Vieieccccccccccscescsscssessessessesscsessessessessaessessessesseseseees 1 1. Sinh học tế bào ung thư VÚ.-- 2-2 2S£+E‡SE‡EEEEE2EE2EEEEEEEEESEkrrrrrerree 2 1.
Cơ sở phân tử của ung thư VÚ. _ Tế bào gốc ung thư VÚ.--- --©- E+SESEE£EE2EE2EEEEEEEEE121121121 7111111. Phân lập va marker phân tử. Những đặc tinh quan trong của tế bao gốc ung thư vú [110, 114].
Nuôi cấy tế bao ung thu dùng trong sang lọc thuốc. Nuôi tế bào lớp đơn (nuôi 2D) .----2-©52 2+SE£EE££Et£Et2EzEzExerxeree 19 1. Nhu cầu nuôi khối tế bào 3 chiều (nuôi 3D). Ưu điểm của mô hình nuôi tế bào 3D dùng trong sàng lọc thuốc.
Các phương pháp nuôi cấy tế bào 3D. Sự biểu hiện các protein kết nối tế bào — tế bào, tế bào và chất nên ngoại bào khi nuôi cấy 3D. Sàng lọc thuốc trong nghiên cứu điều trị ung thư. Tinh hình trong ƯỚC.
Tình hình nghiên cứu trên thế giới.---- 2 5¿2++2z++zx+zxz+zxzzzed 32 1. Các liệu pháp điều tri ung thư chính dựa vào hợp chat thiên nhiên. Ly do cho sự cần thiết nuôi cấy tế bào gốc ung thư vú ở dạng 3D cho sàng lọc các cao chiết thực vật có độc tính trên tẾ bảO. VAT LIEU - PHƯƠNG P.
Sơ đồ các nội dung trong nghiên cứu trong luận án. Vat WOU eee. Đối tượng thí nghiệm. Thiết bị, dụng cụ, hóa CHẤT.
Sc-Sc St E111 E121011211112111111111111 1111 1x. Các phương pháp nuôi, phân lập tế bào gốc ung thư vú người Việt Nam (09. Phương pháp nuôi cấy tẾ bào. Phương pháp phân tách tế bào băng kháng thé có hạt từ tinh (MACS).
Phương pháp phân tích quần thể tế bào bằng phương pháp [9ÀA41905191)A 200070777.gdẠG,:|-ỒÔỒốỐ ÔỒ 49 2. Phương pháp phân tích chu kì tế bào bang dong chảy. Các phương pháp dùng trong thiết lập mô hình nuôi 2D, 3D. Phương pháp đo tín hiệu tế bào bằng MTTT.--- 2c sz+cz+czrserxees 51 2.
Phương pháp đo tin hiệu tế bào bằng Resazurin. Phương pháp dựng đường cong tăng trưởng và thời gian nhân đôi của dòng tẾ bàO. Phương pháp nuôi cấy trên đĩa được tráng agarose. Phương pháp nuôi cấy trên đĩa giọt tre0.
Phuong pháp đánh giá lõi hoại tỬ. Phương pháp nuôi cấy trong chất nền matrigel. Phương pháp RT-PCR. Phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch.-----2- 25552 2x+sz>+zs2 58 iv 2.
Cac phurong phap khac 1n. Phương pháp thê hiện số liệu bang bang màu. Phương pháp phân tích quần thé aopotosis. Phương pháp xử lý số liệu.--- 2 + + 2E+2EE2EEEEEEEEEEEEEEEErrrkervees 62 CHƯƠNG 3.
KET QUA - BAN LUẬNN.--ccee©ccesecEE+eeeeEErxestetrxessrrrreesrrrree 63 3. Phân lập tế bao gốc ung thư vú CD44'/CD24, khảo sát sự tăng trưởng, kha năng tạo mamosphere và biểu hiện ABCG2. Phân lập tế bào gốc ung thư vú VN9 CD44+/CD24-. Khảo sát sự tăng fTƯỞng.- --- -ctnnnn HgHnHnHnH gh n nh nnưh 64 3.
Đánh giá khả năng tạo mamosphere và biểu hiện ABCG2. Thiết lập mô hình nuôi 2D tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú và đánh giá mô hình với thuốc chuẩn Doxorubicin. Khảo sát mật độ tế bao và thuốc nhuộm thích hợp. Đánh giá mô hình nuôi 2D với thuốc chuẩn Doxorubicin.
Quy trình thử chat kháng phân bao trên tế bao ung thư vú va tế bào gốc Ung thr VO NUG1 2D 0110157. Thiết lập mô hình nuôi 3D tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú và đánh giá mô hình với thuốc chuẩn Doxorubicin và Tirapazamine. Khảo sát, đánh giá kết quả nuôi tế bào theo mô hình 3D bằng 3 phương Phap khac hau 0 -----31. Đánh giá mô hình nuôi 3D sử dung đĩa giọt treo và chat nền matrigel với thuốc kháng phân bào Doxorubicin.
Đánh giá mô hình nuôi 3D sử dụng chất nền matrigel với thuốc kháng phân bào 'TirapazaimIne. Thử nghiệm tính ồn định tạo khối tế bao của mô hình nuôi 3D trên một số dòng tế bào khác .---- + HT HT HT HT HT HT HT HH Hi 114 3. Quy trình thử chất kháng phân bào trên tế bào ung thư vú và tế bao gốc ung thư vú nuôi 3Ì. So sánh biéu hiện một số gen, ty lệ quần thể tế bào CD44+/CD24- trong mô hình nuôi 2D và mô hình nuôi 3D dùng matrigel.
Sự khác nhau về biểu hiện ở mức phiên mã các gen liên quan đến methyl 3. Sự khác nhau về biểu hiện ở mức phiên mã gen trong con đường [J7. Sự khác nhau về biéu hiện protein liên quan đến liên kết tế bào giữa mô hinh 2D 6P. Sự khác nhau về ti lệ quan thé CD44+/CD24- giữa mô hình 2D va 3D 3.
Đề xuất việc chọn mô hình nuôi 2D hoặc nuôi 3D dùng trong sàng lọc hop chất có độc tính trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú. Đánh giá khả năng sử dụng tế bao gốc trung mô từ mô mỡ làm tế bào đối chứng thay thế nguyên bào sợi trong quy trình sàng lọc chất có độc tính lên tế bảo 3. Ứng dụng mô hình nuôi 2D, 3D tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú trong sảng lọc độc tính tế bào của 34 cao chiết thực vật. Thiết lập các thông số của quy trình sảng lọc.
Phân tích tong thé IC50 của 34 cao chiẾt. Xác định chi số tác dụng phụ SEI. Kết quả sang lọc độc tính tế bào của 34 cao Chiét. Đánh giá tiềm năng sử dung của cao chiết cây Sao đen Hopea odorata.
KET LUẬN — KIÊN NHỊ,. << se te +ee£EseEkseEkeerkeeresereseree 158 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỖ.-e<©ce<©cee+vee+EseEtserkeecrsere 161 vi TÀI LIEU THAM KHẢ O.--ẻ-©©ẻ Sẻ ©t*£EE£EEt£EEE£EEteEEtEEtEEeEEeEEseEkeeEkserkserkscree 162 PHỤ LỤC Ó00000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000060000 0060 vi DANH MỤC TỪ VIET TAT THUẬT NGỮ TEN DAY DU TIENG VIET ABC ATP-binding cassette Cassette gin ATP ABL Tyrosine-protein kinase ABL ADSCs Adipose Derived Stem Cells | Tế bao gốc trung mô từ mô mỡ AKT Protein kinase B Protein kinase loại B ALDH Aldehyde dehydrogenase BRCAT-associated RING BARDI domain protein 1 BRCA Breast Cancer Gene Gen lién quan ung thu vu CDK Cyclin-dependent kinases Kinase phụ thuộc Cyclin CSC Cancer Stem Cell Tê bao gốc ung thư DNMT DNA methyltransferases Enzym methyl hóa DNA Dòng tế bào ung thư tuyến tiền DU145 Prostate cancer cell line liệt ECM Extra Cellular Matrix Chất nên ngoại bào EGF Epidermal growth factor Nhân tổ tăng trưởng biéu mô Epithelial Cell Adhesion ol Ep-CAM Phân tử kêt nôi biêu mô Molecule gen điều chỉnh phản ứng của tế The Growth Arrest and DNA „ GADD45 bào với stress, sự hình thành khôi Damage u Trung tâm thu thập dữ liệu ung GLOBOCAN | Global Cancer Observatory : thư toàn câu HA Hyaluronic acid HER2 Human Epidermal growth Thụ thé yếu tô tăng trưởng biéu bì factor receptor 2 người HTS Highthrouput Screening Sang lọc thông lượng cao Vili Michigan Cancer Foundation- MCF-7 : dòng tế bào ung thư vú Mouse double minute 2 MDM2 homolog MMP Matrix metallopeptidases (3-(4,5-Dimethylthiazol-2- MTT yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) Neuronal cell adhesion cố ` N-CAM Phân tử kết nôi thuộc thân kinh Molecule NCI National Cancer Institute Viện ung thư quốc gia Nonobese diabetic/severe tiéu đường kết hop suy giảm miễn NOD/SCID ‹ combined immunodeficiency | dịch tram trọng NPC Neuro Progenitor Cell Té bao tién than than kinh PANC03.27 Pancreatic Cancer Cell line Dong té bao ung thu tuy Dong té bao ung thu tuyén tién PC3 human Prostate Cancer 3 liệt PEG Polyethylene glycol PI3K Phosphoinositide 3-kinase Poly hydroxyethyl Poly-HEMA Hydrogel methacrylate Phosphatase and tensin pTEN homolog Gen mã hóa protein sửa chữa đứt RADSI gãy DNA Human Ewing Sarcoma Cell , ; SK-NEP-I Dòng tê bảo sarcoma ở người Line ix Transforming growth factor Nhân tố tăng trưởng chuyền dang TGF-B beta beta Vascular cell adhesion ¬ V-CAM Phân tử kết nôi nội mach Molecule VN9 Vietnamese breast cancer cell | Dòng tế bào ung thư vú người line 9 Việt Nam 9 WHO World Health Organization Tổ chức y tế thé giới DANH MỤC BANG Bảng 1. Ưu và nhược điểm của các phương pháp nuôi cấy 3D [ 14]. Thành phan màng cơ sở tế bào chuột EHS [62] .---2-©5+©cz+cxecs+zssrxczss 28 Bảng 1.
Danh sách các thuốc trị ung thự [70] cccsccccccsscesvessesssessesssessessesssessessesssessesssesseess 35 Bảng 2. Thư viện 34 cao chiết sử dụng trong dé ti co. Các môi sử dụng trong dé tdi ccecceccccccecsessssssesssessesseessessesssessessesssessessisssessessseeseees 43 Bảng 2.
Nội dung được bảo vệ bản quyền — Tải xuống đầy đủ
Câu hỏi thường gặp
Luận án "Mô hình nuôi tế bào 2D, 3D sàng lọc cao chiết thực vật ung thư vú" nghiên cứu về vấn đề gì?
Luận án tiến sĩ nghiên cứu mô hình nuôi tế bào 2D, 3D để sàng lọc cao chiết thực vật trên tế bào ung thư vú và tế bào gốc ung thư vú VN9 CD44+/CD24-.
Luận án "Mô hình nuôi tế bào 2D, 3D sàng lọc cao chiết thực vật ung thư vú" được bảo vệ tại trường nào?
Luận án này được bảo vệ tại Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Năm bảo vệ: 2021.
Luận án "Mô hình nuôi tế bào 2D, 3D sàng lọc cao chiết thực vật ung thư vú" thuộc chuyên ngành gì?
Luận án "Mô hình nuôi tế bào 2D, 3D sàng lọc cao chiết thực vật ung thư vú" thuộc chuyên ngành Sinh lý học người và động vật. Danh mục: Công Nghệ Sinh Học.
Luận án "Mô hình nuôi tế bào 2D, 3D sàng lọc cao chiết thực vật ung thư vú" có bao nhiêu trang?
Luận án "Mô hình nuôi tế bào 2D, 3D sàng lọc cao chiết thực vật ung thư vú" có 204 trang. Bạn có thể xem trước một phần tài liệu ngay trên trang web trước khi tải về.
Cách tải luận án "Mô hình nuôi tế bào 2D, 3D sàng lọc cao chiết thực vật ung thư vú" về máy như thế nào?
Để tải luận án về máy, bạn nhấn nút "Tải xuống ngay" trên trang này, sau đó hoàn tất thanh toán phí lưu trữ. File sẽ được tải xuống ngay sau khi thanh toán thành công. Hỗ trợ qua Zalo: 0559 297 239.